As2O3对胃癌细胞SGC7901/ADR阿霉素耐药性逆转作用
【摘要】 目的 探讨三氧化二砷（As2O3）对胃癌细胞SGC7901/ADR阿霉素（ADM）耐药性的逆转作用和对P?gp、GST?π表达的影响。方法 以胃癌多药耐药细胞株SGC7901/ADR为靶细胞，用MTT法检测SGC7901/ADR细胞对ADM的敏感性，用流式细胞仪检测细胞内药物浓度及免疫组织化学法检测细胞P?gp、GST?π表达。结果 0.4～0.8μmol/L As2O3对耐药细胞SGC7901/ADR无明显毒性(P>0.05)。As2O3可下调P?gp、GST?π表达，提高SGC7901/ADR细胞内ADM浓度，增加SGC7901/ADR细胞对ADM的敏感性。结论 As2O3能够抑制SGC7901/ADR细胞P?gp、GST?π表达，增加细胞内ADM药物浓度而部分逆转其对ADM的耐药性。
【关键词】 胃癌 SGC7901细胞株 SGC7901/ADR细胞株 多药耐药 三氧化二砷
0 引言
三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）注射液主要用于急性早幼粒白血病。最近研究发现，As2O3可引起白血病细胞K562/ADR P?gp表达下调,使其多药耐药性部分逆转，具有增强肿瘤细胞化疗敏感性的作用[1]；而As2O3对实体瘤细胞株SGC7901/ADR是否具有相同作用还未见报道。本实验以SGC7901/ADR细胞为研究对象，通过MTT法、流式细胞仪和免疫组织化学等方法研究As2O3对SGC7901/ADR细胞的逆转作用及可能的机制，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物与试剂 As2O3（即亚砷酸注射液，哈尔滨伊达制药有限公司产品,批准文号：国药准字H：19990191；批号：021031），MTT（美国Sigma公司产品），盐酸阿霉素（ADM）（浙江海正药业有限公司产品，批准文号：国药准字H33021980，批号：021005），鼠抗人P?gp、GST?π单克隆抗体及即用型第二代免疫组化ElivisionTM plus广谱试剂盒（福州Maixin生物工程公司产品）。
1.1.2 细胞 人胃癌细胞株SGC7901和SGC7901/ADR,由第四军医大学西京全军消化内科研究所惠赠。
1.2 方法
1.2.1 As2O3细胞毒性测定 取对数生长期的细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的As2O3(3.2～0.1μmol/L)，参照[2]说明进行，每个实验重复3次,选取细胞存活率>90％的药物浓度为该药的非细胞毒性浓度。
1.2.2 MTT法测定细胞药物敏感性 实验分3组进行，按前述方法培养细胞48 h，测定A490nm值。分组如下：（1）SGC7901（或SGC7901/ADR）细胞+ADM（0.01～100mg/L，终浓度）；（2）SGC7901（或SGC7901/ADR）细胞+ADM（0.01～100mg/L，终浓度）+As2O3（0.4μmol/L，终浓度）；（3）SGC7901（或SGC7901/ADR）细胞+ADM（0.01～100mg/L，终浓度）+As2O3（0.8μmol/L，终浓度）。
1.2.3 细胞内ADM荧光强度测定 实验分3组进行，按前述方法培养细胞24h，按照文献[3]采用流式细胞仪测定细胞内ADM荧光强度。分组如下:（1）加入ADM（5mg/L，终浓度）；（2）加入As2O3（0.4μmol/L，终浓度）和ADM（5mg/L，终浓度）；（3）加入As2O3（0.8μmol/L，终浓度）和ADM（5mg/L，终浓度）。
1.2.4 用免疫组织化学方法测定细胞P?gp、GST?π表达 实验分3组进行：（1）SGC7901；（2）SGC7901/ADR；（3）SGC7901/ADR+As2O3（0.8μmol/L，终浓度）。调整细胞数为1×105/ml滴于处理过的载玻片上，培养4h。按Elivision二步法免疫组织化学试剂盒说明进行。
1.2.5 统计方法 采用SPSS10.0统计软件中的t检验作统计学分析。
2 结果
2.1 As2O3的细胞毒作用
As2O3在0.8μmol/L和0.4μmol/L时，耐药细胞SGC7901/ADR的存活率分别为93.92％和95.84％；相同剂量的As2O3对敏感细胞SGC7901也无明显细胞毒性。故将0.8μmol/L和0.4μmol/L作为非细胞毒性药物浓度。
2.2 MTT法测定细胞药物敏感性
0.8μmol/L和0.4μmol/L As2O3与ADM同时作用，可降低耐药细胞的存活率，增加耐药细胞对ADM的敏感性，逆转倍数分别为2.11和1.58（P<0.01）。与0.4μmol/L As2O3相比，0.8μmol/L的As2O3能显著增加耐药细胞对ADM的敏感性（P<0.05）；而As2O3对敏感细胞却无增敏作用（P>0.05），见表1。
表1 As2O3对SGC7901/ADR细胞ADM耐药性的逆转作用（略）
★:vs SGC7901; ☆:vs SGC7901/ADR
2.3 As2O3对细胞内ADM浓度的影响
通过流式细胞仪检测细胞内ADM荧光强度， 分析As2O3对SGC7901/ADR细胞内ADM浓度的影响。 由表2可见,SGC7901/ADR细胞内ADM荧光强度比SGC7901低4.65倍(P<0.05)； 加入0.4μmol/L As2O3后，SGC7901/ADR细胞内荧光强度无显著性增加(P>0.05)；加入0.8μmol/LAs2O3后，耐药细胞内ADM的荧光强度明显增加（P<0.01），增加倍数为1.32倍。
2.4 As2O3对SGC7901/ADR细胞P?gp、GST?π表达的影响
耐药细胞的P?gp、GST?π表达明显高于敏感细胞（P<0.01），加入As2O3后，耐药细胞P?gp、GST?π表达明显降低（P<0.05），见表3。
表2 As2O3对SGC7901/ADR细胞内ADM荧光强度的影响（略）
★：vs SGC7901;☆:vs SGC7901/ADR
表3 As2O3对SGC7901/ADR细胞P?gp、GST?π表达的影响（略）
★：vs SGC7901;☆:vs SGC7901/ADR
3 讨论
肿瘤细胞对化疗药的多药耐药性（MDR）是临床上的棘手问题，尤其在实体瘤中更为突出。各种研究表明，肿瘤细胞MDR的产生是由多种因素共同作用的结果，其中肿瘤细胞膜上的药物外流泵向外排出药物，导致细胞内药物浓度降低是引起MDR的主要原因, P?gp作为ABC家族的主要成员在化疗后表达增加，部分解释了MDR产生的原因[4]。人们在探讨MDR发生机制的同时，也在寻找更为有效的逆转剂。我们研究发现0.4～0.8μmol/L的As2O3对细胞无明显毒性(P<0.01)，可降低P?gp表达（P<0.05），增加细胞内ADM浓度（P<0.05）,提高耐药细胞SGC7901/ADR对ADM的敏感性。因此我们推断As2O3部分逆转SGC7901/ADR细胞对ADM的耐药性与降低P?gp表达，抑制ADM外流有关。
GST是一类参与化疗药的解毒、降低脂酯过氧化及修复DNA损伤有关的酶，在氮芥类化合物及ADM耐药细胞株中的改变最为显著[5]。As2O3具有与细胞内GSH结合的作用，从而降低As2O3的细胞毒性，同样也可与GST?π内的巯基结合抑制其活性，从而降低细胞内GSH含量，而MRP是一种GSH偶联的外流泵[6]，那么As2O3是否能够通过抑制GST?π活性来影响MRP功能从而部分逆转肿瘤细胞的耐药性呢？在本研究中，我们发现0.8μmol/ml As2O3可显著降低SGC7901/ADR细胞GST?π表达（P<0.05），因此，我们推测As2O3通过抑制肿瘤细胞内GST?π的表达参与了对SGC7901/ADR细胞ADM耐药性的部分逆转作用。
本实验研究表明，As2O3可降低P?gp和GST?π表达，增加细胞内ADM浓度,部分逆转SGC7901/ADR胃癌细胞对ADM的耐药性，且逆转浓度远低于临床血药浓度，是具有临床应用价值的新型逆转剂。然而肿瘤细胞的MDR是由多种因素、多种机制共同作用的结果，涉及到多种转运蛋白的改变、解毒系统的激活、凋亡通路的改变、DNA修复系统的增强等等，特别是多种转运蛋白共同转运一种抗癌药形成的耐药性是导致目前的逆转剂只能部分逆转肿瘤细胞耐药性的重要原因。随着人们对多药耐药机制的不断深入研究及新的不同机制的逆转剂的出现，联合应用As2O3和不同作用机制的逆转剂将会更有效地逆转肿瘤细胞的耐药性。
【】
［1］ WEI Hulai,SU Haixiang, BAI Decheng,et al.Arsenic trioxide inhibits p?glycoprotein expression in multidrug?resistant human leukemia cells that overexpress the MDR1 gene［J］.Chin Med J, 2003,116 (11):1644?1648.
［２］ Lin HL.Liu TY,Wu CW,et al.Berberine modulates expression of mdr1 gene product and the responses of digestive track cancer cells to Paclitaxel［J］. Br J Cancer,1999,81(3):416?422.
［3］ Tanaka S,Aizawa K,Katayangi N,et al.Flow cytometric analysis of early steps in development of adriamycin resistance in a human gastric cancer cell line［J］. Jpn J Cancer Res,1994,85(1):86?92.
［４］ Ramesh S, Shanthi P, Krishnan KB,et al.Multidrug resistance 1 gene expression in Indian patients with gastric carcinoma［J］. Indian J Gastroenterol,2003,22(1):19?21.
［5］ Mattern J,Koomagi R,Volm M.Expression of drug resistance gene products during progression of lung carcinomas［J］. Oncology Reports,2002,9(6):1181?1184.
［６］ Saengkhae C,Loetchutinat C,Garnier?Suillerot A.Kinetic analysis of rhodamines efflux mediated by the multidrug resistance protein (MRP1)［J］.Biophys J,2003,85(3):2006?2014.
