Genistein对耐药卵巢癌细胞SKOV?3增殖、凋亡和顺铂敏感性的影响
【摘要】 探讨Genistein对耐药卵巢癌细胞SKOV?3增殖、凋亡和顺铂敏感性的影响。方法 采用MTT法检测Genistein单用及合用顺铂对细胞增殖的影响，流式细胞仪分析Genistein及Genistein联合顺铂对细胞周期和凋亡的影响。结果 Genistein对SKOV?3细胞增殖表现出浓度依赖性的抑制作用，并显著提高了其对顺铂的敏感性（P<0.05）；0.625～5μg/ml顺铂与2.5～10μg/ml Genistein合用基本表现为协同作用。5、10μg/ml Genistein均可将细胞阻滞于G2/M期并诱导一定程度的凋亡，10μg/ml Genistein还可进一步的干扰S期进程；当顺铂与Genistein合用时，两种药物在干扰SKOV?3细胞周期和诱导凋亡方面表现为显著的协同效应。结论 Genistein能够抑制耐药卵巢癌细胞SKOV?3的增殖，并显著增强该细胞对顺铂的敏感性。
【关键词】 Genistein 顺铂 卵巢癌 耐药
0 引言
肿瘤耐药是卵巢癌患者生存率低的重要原因，因此迫切需要新型有效的化疗方案。Genistein（又称染料木黄酮）是一种有潜力的化疗增敏剂，广泛存在于大豆和多种中草药中，具有预防肿瘤的作用。近来研究表明Genistein还可以增强多种耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[1,2]，但Genistein是否可以增强耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性尚未见报道。本文从增殖、凋亡和顺铂敏感性方面分析了Genistein对耐药卵巢癌细胞SKOV?3的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV?3，由本科实验室保存，该细胞系对顺铂等多种药物耐药[3]。Genistein、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma，Genistein用DMSO配成储备液（10mg/ ml），?20℃保存；顺铂（齐鲁制药厂）；噻唑蓝(MTT)购自Amresco。细胞周期试剂盒为DNA?Prep Stain kit(BECKMAN?COULTER)；Annexin V?FITC/PI凋亡试剂盒为Apoptosis Detection Kit(Biovision)。全自动酶标仪为Wellscan MK3型(Labsystems Dragon)；流式细胞仪为ELITE ESP型（BECKMAN?COULTER）。
1.2 方法
1.2.1 顺铂、Genistein单药对SKOV?3细胞增殖的影响 收集对数生长期细胞，8×103个/孔接种于96孔培养板，37℃、50ml/L CO2孵箱培养12h，细胞贴壁后弃去培养液，加入含不同浓度药物的培养基200μl，顺铂组浓度为0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml，Genistein组浓度为2.5、5、10、20、40、80μg/ml， 为评估DMSO对实验的影响，设6个DMSO组（浓度与Genistein各组DMSO含量一致），同时设对照组，每组设6个复孔。继续培养72h，每孔加入MTT(5mg/ml，20μl),继续孵育4h后弃培养液，每孔加入DMSO150μl，振荡10min，酶标仪测吸光度(A490)，按以下公式：细胞增殖抑制率=（对照组A490值?实验组A490值）/对照组A490值× 100%，取6孔均值绘制浓度效应曲线。
1.2.2 顺铂联合Genistein对SKOV?3细胞增殖的影响 方法基本同前。顺铂选0.625、1.25、2.5、5μg/ml 4个浓度; Genistein选2.5、5、10、20、40μg/ml 5个浓度，设对照、单药、联合共30种组合。用以下公式计算两药的相互作用: q=E(AB)/[EA+EB?EA×EB]。其中E(AB)为两药合用的抑制率，EA和EB为各药单用的抑制率，q>1.15为协同作用，0.85 1.2.3 顺铂、Genistein单药及联合对周期和凋亡的影响 根据MTT结果，顺铂浓度选2.5μg/ml, Genistein选5.0、10.0μg/ml，设对照、单药和联合共6组。加药48h后收集细胞，分别按DNA?Prep Stain Kit试剂盒和Apoptosis Detection Kit试剂盒说明书进行细胞固定、染色，上流式细胞仪分析。 1.3 统计方法 2 结果 2.1 顺铂、Genistein单药对SKOV?3细胞增殖的影响 图1 顺铂抑制耐药卵巢癌细胞系skov?3增殖的浓度效应曲线（略） 图2 Genistein抑制耐药卵巢癌细胞系skov?3增殖的浓度效应曲线（略） 2.2 顺铂、Genistein联用对SKOV?3细胞增殖的影响
采用SPSS10.0进行统计学处理。
顺铂对SKOV?3细胞增殖的抑制作用随浓度的增加呈平缓的增强趋势，当浓度达10μg/ml以上时，顺铂对增殖的抑制率才急剧上升，并在20μg/ml时达到51.6%，见图1，与对照组相比差异显著(P<0.05)。而顺铂在2.5μg/ml浓度以下时，对SKOV?3细胞增殖的抑制作用与对照组无显著差异(P>0.05)。
Genistein对SKOV?3细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性，5μg/ml以上的各组与对照组差异显著(P<0.01)，当Genistein浓度达40μg/ml后，抑制率急剧上升，80μg/ml Genistein的抑制率达到96.9%。而用于溶解Genistein的DMSO对SKOV?3细胞增殖并无明显影响(P=0. 398)，见图2。
两药联用的增殖抑制率随着各自浓度的增加而增加，各组与对照组及相应单药组之间差异显著（P<0.05）。顺铂合用2.5～10μg/ml Genistein基本表现为协同作用(q>1.15)；与20、40μg/mLGenistein合用时表现为相加作用(0.85
表1 顺铂联合Genistein对SKOV?3细胞增殖的抑制率（略）
2.3 Genistein、顺铂单药及联用对SKOV?3细胞周期和凋亡率的影响
正常的SKOV?3细胞绝大多数处于G1期；2.5μg/ml顺铂对SKOV?3细胞周期无明显影响；5μg/ml和10μg/ml Genistein分别使G2/M期SKOV?3细胞比例增加至15.3%、15.9%，10μg/ml还可使S期细胞比例升高至25.9%；当顺铂与Genistein联合作用时，可使G2/M期阻滞得到显著加强，分别达67%和64.4%，顺铂合用10μg/ml Genistein还可进一步将部分细胞阻滞于S期，见图3。
表2 顺铂联合Genistein抑制SKOV?3细胞增殖的协同作用值（q值）（略）
对照组凋亡率为2.6%；2.5μg/ml顺铂、5μg/ml Genistein对SKOV?3细胞凋亡率无明显影响，分别为3.1%、3.2%，10μg/ml Genistein可使凋亡率增加至6.4%；当2.5μg/ml顺铂与以上2种浓度Genistein联合作用时，凋亡率的明显升高，分别达到9.1%和20.8%。
图3 顺铂联合Genistein对SKOV?3细胞周期的影响（略）
3 讨论
3.1 Genistein对SKOV?3细胞增殖和凋亡的影响
Gercel等[4]研究Genistein对五种卵巢癌细胞系的影响，发现2.5μg/ml Genistein的抑制率为0%～23%，在39μg/ml Genistein作用下可以达到50%～80%；而且所有浓度的Genistein均诱导了Caspase?3的表达，造成不同程度的凋亡。但Genistein对耐药卵巢癌细胞系作用如何呢？本实验发现5μg/ml以上浓度的Genistein对耐药卵巢癌细胞SKOV?3具有明确的增殖抑制作用，当Genistein浓度达40μg/ml以上时，抑制作用呈现急剧上升趋势，80μg/ml几乎能完全抑制癌细胞的增殖。
Mansour等[5]研究发现，Genistein能将恶性B细胞瘤阻断在细胞周期的G2/M期，从而抑制细胞增殖并诱导凋亡，其作用主要是通过下调细胞周期蛋白cdc25C、cdk1, 并抑制抗凋亡蛋白survivin和Ian?5的表达。本实验也发现Genistein可将SKOV?3细胞阻滞于G2/M期，并诱导一定程度的细胞凋亡；另外还发现10μg/ml Genistein可同时阻滞部分细胞于S期，具体机制尚不清楚。
3.2 Genistein对SKOV?3细胞顺铂敏感性的影响
Genistein除了本身的抗肿瘤活性外，尚可在一定程度上逆转肿瘤细胞的多药耐药性，起到化疗增敏作用，该作用主要与其可下调耐药肿瘤细胞内过多表达的抗凋亡蛋白bcl?2、bcl?XL等有关。如Genistein可诱导耐药乳腺癌细胞系凋亡，其作用和降低抗凋亡蛋白bcl?2的表达相关 [1]；Genistein也可通过降低抗凋亡因子bcl?XL的表达，逆转人前列腺癌细胞系PC?3对十字孢碱的耐药 [2]。本实验中发现SKOV?3细胞明显对顺铂耐药，血清峰值浓度（2.5μg/ml）以下的顺铂对SKOV?3细胞增殖未见明显影响，这与报道基本一致[3]。但与Genistein合用时，血清峰值浓度以下的顺铂明显地抑制了SKOV?3细胞的增殖。干扰细胞周期并诱导凋亡是顺铂肿瘤的重要途径，而血浆峰值浓度的顺铂对SKOV?3细胞周期和凋亡率几乎无影响，但与Genistein合用时，可引起细胞G2/M期高度阻滞，相应的凋亡率也明显升高；与10μg/ml Genistein合用还进一步干扰了细胞的S期进程。
综上所述，Genistein对耐药卵巢癌细胞SKOV?3呈现浓度依赖性的增殖抑制作用，并改善了SKOV?3细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂的抑制、杀伤作用。Genistein自大豆等天然食物中提取，Ⅰ期临床试验中除偶见皮疹外，未见任何严重的毒副反应[6]，因而很有希望成为临床治疗卵巢癌的辅助药物。关于Genistein增强耐药卵巢癌对顺铂敏感性的具体机制还有待进一步研究。
【文献】
［1］ Katdare M, Osborne M, Telang NT. Soy isoflavone genistein modulates cell cycle progression and induces apoptosis in HER?2/neu oncogene expressing human breast epithelial cells [J]. Int J Oncol, 2002, 21(4):809?815.
[2] Li X, Marani M, Mannucci R.et al. Overexpression of BCL?X(L) underlies the molecular basis for resistance to staurosporine?induced apoptosis in PC?3 cells [J]. Cancer Res, 2001, 61(4):1699?1706.
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[5] Mansour A, McCarthy B, Schwander SK.et al. genistein induces G2 arrest in malignant B cells by decreasing IL?10 secretion [J]. Cell Cycle, 2004, 3(12): 1597?1605.
[6] Takimoto CH, Glover K, Huang X, et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of unconjugated soy isoflavones administered to individuals with cancer [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2003, 12(11 Pt 1):1213?1221.
