SEREX 方法在筛选和鉴定骨肉瘤抗原中的应用
【关键词】 SEREX方法 骨肉瘤 ；抗原
0 引言
肿瘤抗原及其编码基因的理论研究和实验技术使肿瘤抗原的筛选和肿瘤免疫的研究进入一个新阶段[1]。肿瘤抗原的筛选与鉴定是临床特异性免疫的前提和关键,随着对肿瘤生物学和肿瘤免疫学的深入认识,设计了基于体液免疫的重组cDNA 文库的血清学分析(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries, SEREX) 方法, 简便易行[2]。本文对SEREX 方法的原理、技术步骤、及其在骨肉瘤肿瘤基因筛选的应用及研究现状作一简要介绍。
1 SEREX方法原理
重组cDNA 表达文库的血清学分析最早由Pfreundsch 小组建立[2]。SEREX 方法将分子克隆技术和利用患者自体血清对肿瘤细胞的自体分型技术融为一体,不仅可检测抗体反应,而且能在抗原与患者自体血清反应的基础上,直接从分子水平确定具有免疫原性的肿瘤蛋白质(抗原)。此方法的流程主要是以新鲜瘤组织或细胞样本构建cDNA 文库并连接入噬菌体表达载体,以重组的噬菌体转染E. coli 大肠杆菌,将细菌表达的重组蛋白转移至NC膜上,与稀释后的病人自体血清共孵育,用酶联特异性抗人IgG 二抗识别与高滴度血清抗体反应的克隆,阳性克隆随后亚克隆化,分离出单个插入片段,并确定此插入cDNA 的核苷酸序列,在相应的数据库中进行比对,了解其染色体定位和推测可能的功能作用,最后分析该基因的组织表达谱。
2 SEREX技术特点
SEREX方法与其他鉴定肿瘤抗原的方法比较,有如下特点: ①用新鲜瘤组织或细胞样本构建cDNA文库,避免了体外培养肿瘤细胞以及因过度培养细胞导致的相关抗原基因缺失或不表达; ②将病人血清稀释至1∶100～1∶1 000, 仅检测高滴度的IgG 抗体,使得免疫分析仅限于可诱导出强免疫反应(在同源宿主体内)及有共同T 细胞辅助的抗原; ③cDNA表达克隆的血清分析,不只限于分析肿瘤细胞的表面抗原,它涵盖了由肿瘤基因编码的蛋白质; ④与单克隆抗体技术比较,SEREX 是运用多特异性血清抗体检测在溶解的细菌斑中高度富集的单克隆抗原。因为肿瘤抗原的cDNA 序列可以直接测定,所以也可推导确定抗原的氨基酸序列; ⑤运用northern blots和RT?PCR 检测肿瘤抗原的mRNA 的表达,确定肿瘤抗原的组织表达谱。但SEREX 方法也不能检测肿瘤表达的所有抗原,如糖基化的抗原决定簇和在细菌中表达时发生构像改变的抗原决定簇可能被漏检。此外,对某些在肿瘤的不同阶段表达的抗原,若取新鲜组织标本的时间与该抗原表达的阶段不一致,也将被漏检。尽管如此,SEREX法仍不失为一种有效、方便的鉴定肿瘤抗原的方法。
3 SEREX方法在筛选和鉴定骨肉瘤抗原中的应用和问题
根据SEREX技术，廖博等[ 3,5]已完成了人骨肉瘤9901及9607细胞cDNA表达文库的构建和鉴定，廖博等在构建人骨肉瘤9901时[3]，所建文库容量为1.5×106。根据Clare 公式[4]所需文库的大小，计算公式是：N＝ln（1－P）/ln（1－1/n）（N 为所需克隆数，P 为要求的概率，1/n 为低丰度mRNA在总mRNA 中所占比例。若要99％的概率得到一个低丰度克隆，所要求的文库克隆数为1.7×105。其所建文库保证了低丰度基因的有效克隆，符合标准，插入片段平均在1.4kb以上，且大小各不相同，多样性好，故适合用于筛选目的克隆。在构建人骨肉瘤9607时[5]，所建文库容量为1.3×106。根据Clare 公式，若要99％的概率得到一个低丰度克隆，所要求的文库克隆数为1.7×105，所建文库也保证了低丰度基因的有效克隆，符合标准，插入片段平均在1.3kb以上，且大小各不相同，多样性好，也适合用于筛选目的克隆。
Yuki等[6]也成功的构建了人骨肉瘤2000细胞cDNA表达文库。Yuki等所建文库容量为3×106，插入片段平均在1.5kb以上。
美国克隆技术公司关于良好基因文库的质量标准是： 原始库的重组子数大于5×105～5×107，重组百分率大于90%，插入cDNA片段不小于0.3kb，平均插入片段大于1.0kb以上所建文库都是经过反复多次试验才成功建立起来的质量合格的骨肉瘤cDNA文库。
由上可见，虽还未筛选出骨肉瘤的特异性抗原，但成功的构建出的骨肉瘤的cDNA表达文库为进一步从中筛选出骨肉瘤特异性抗原，为建立临床免疫治疗体系、制备出骨肉瘤疫苗以及为骨肉瘤的血清学诊断创造了必要的条件。
4 SEREX 技术存在的问题及改进
4.1 cDNA文库的质量 cDNA 文库的质量主要反映在文库的代表性和重组cDNA 片段的序列完整性两个方面。文库的质量可用库容量来衡量,实际中由于各种操作误差及系统误差,要求一个有代表性的cDNA 文库至少要具有1 ×106 以上的库容量[7]。重组cDNA 片段的完整性是反映cDNA文库质量的另一重要因素,故要求文库中重组cDNA片段应尽可能完整地反映天然基因的结构。但实际应用中重组阳性克隆插入的cDNA片段并非完整序列,同时已鉴定的新的肿瘤抗原基因,其正常对照序列尚未建立,而肿瘤标本中又可能掺杂有正常细胞或者癌细胞中存在有非突变的等位基因。因此应用SEREX技术确定新的肿瘤抗原时应慎重,应充分利用gene bank和EST数据库提供的资料和其他分子生物学手段,如快速扩增cDNA末端技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE) 获取全长cDNA 片段,这将有助对阳性cDNA克隆序列的研究分析,判定其为已知基因序列还是未知序列,是野生型还是突变型[8?10]。总之,构建一个高质量的cDNA文库,在实际应用中不是一件容易的事情。
4.2 肿瘤标本来源及筛选血清的选择 应用SEREX技术筛选肿瘤抗原,选用新鲜的肿瘤标本还是细胞株构建cDNA 文库,以及选用何种来源的抗血清进行筛选是非常重要的。Sahin等[2]早期利用新鲜肿瘤标本构建cDNA文库,然后用肿瘤病人自体血清筛选,这种方法虽鉴定了许多肿瘤抗原,但仍存在其局限性。为拓宽SEREX 技术鉴定肿瘤抗原的范围,许多学者对方法本身进行了必要的改进。利用细胞株而不是新鲜肿瘤标本构建cDNA文库[11?13],同时除选用自体血清外还利用同种异体血清来筛选cDNA 文库[ 9，11，14?16]。其理论依据为: ①细胞株有着相对单一的转录本库,故用细胞株建库较用新鲜肿瘤标本更具代表性。②包含一种或多种已知肿瘤抗原抗体的异体病人血清,可能是一种更为理想的筛选未知抗原的血清来源。此外用细胞株建库还有其他有利的方面如:缺少正常细胞的污染、排除了B 淋巴细胞产生的假阳性IgG表达克隆等。Toshiro 等[13]用INF?γ转染细胞株以增加其肿瘤抗原的表达,这可能代表了一种SEREX 技术未来应用新的思路。
4.3 抗原的肿瘤相关性 应用SEREX技术筛选肿瘤抗原,目的在于发现新的肿瘤标志物并以之作为肿瘤早期免疫学诊断及肿瘤疫苗研制的候选靶位。然而该技术筛选得到的肿瘤抗原并非都是肿瘤相关抗原,因此在研究中除分析抗原的结构和表达外,检测其对大量不同正常人及肿瘤病人的同种异体血清的反应性,评估其是否为肿瘤相关是至关重要的。在确定一种新的抗原是否具有肿瘤特异性免疫原性之前,必须用大量的正常个体及其他疾病病人的血清进行筛选[17]。此外SEREX技术筛选的肿瘤抗原不一定都可以被肿瘤特异CTL克隆所识别。而一种典型的肿瘤抗原应既可以被SEREX技术筛选得到,同时也可被特异性CTL克隆所识别,因此进一步研究和鉴定肿瘤抗原对CD4＋及CD8＋ T细胞的反应性是SEREX技术的主要方向之一。Jager等[18]在转染分析(transfection array) 和HLA 序列检测(HLA motif analysis)基础上建立了一种分析CD8＋ T细胞对SEREX 技术鉴定抗原反应性的研究方法,值得借鉴。
5 SEREX 的发展前景
人类骨肉瘤肿瘤抗原的鉴定不仅有助于阐明骨肉瘤免疫的分子机制,也是建立新的骨肉瘤免疫学诊断和防治方法的基础。虽然目前还未找到骨肉瘤的特异性抗原，但随着SEREX鉴定抗原的方法不断改进和完善,人类骨肉瘤肿瘤特异性抗原的发现指日可待。大多数人类肿瘤可表达若干种具有免疫原性的蛋白质可表达若干种具有免疫原性的蛋白质,但只有那些具有特异性或有一定优势的抗原(如CT 抗原) 可用于制备疫苗,还可作为大范围人群血清学调查、肿瘤临床诊断以及肿瘤疫苗临床疗效监测的指标。用肿瘤特异的T 淋巴细胞识别肿瘤抗原的多肽,产生多价疫苗,是肿瘤基因疫苗的一个策略。由于分子生物学技术的发展,SEREX 技术将会得到更广泛的应用, 骨肉瘤以及肿瘤的病因学、诊断、可望有突破性的进展。
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