人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达
作者：陈秀军 程玉峰 王来城
【摘要】 ［目的］构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。［方法］通过RTPCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSNIRES2EGFP，转染Hela细胞后，荧光显微镜和Western Blotting检测bax基因的表达情况。［结果］成功构建了带有EGFP的bax基因的逆转录病毒表达载体，并将其转入Hela细胞。［结论］成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株，为探讨bax基因与放射敏感性之间的关系奠定了基础。
【关键词】 bax基因 逆转录病毒表达载体 IRES序列 载体构建
Recombinant Human bax Gene Retroviral Vector Construction and Its Expression in Hela Cells
Abstrac:［Purpose］To construct the human bax gene retroviral expressive vector with EGFP gene and obtain a Hela strain overexpressing bax gene by transfection. ［Methods］Bax gene was cloned from Hela cell with RTPCR. The retroviral vector carrying both bax and EGFP gene was constructed using PCR and enzyme digestion etc, then this new vector pLBaxSNIRES2EGFP was used to transfect Hela cell to establish a new Hela strain, and the expression of the exogenous bax gene was verified by fluorescence microscope and Western Blotting. ［Results］ The recombinant retroviral vector with exogenous bax and EGFP gene was constructed, and the recombinant vector was transfected into Hela cell. ［Conclusion］ The successful establishment of Hela cell strain that overexpresses exogenous bax gene provides the basis for further studies on the relationship between the bax gene expression and the sensitivity to radiotherapy for Hela cell.
Key words: bax gene;retroviral vector;IRES;vector construction
1993年，Oltvai等[1]发现的一种能与Bcl2共沉淀的蛋白质，其分子量为21kD，命名为Bax (Bcl2 associated X protein)，是Bcl2家族的重要的促凋亡蛋白。已有证据表明Bax作为一个重要的促凋亡蛋白，通过对凋亡调节而干预肿瘤发生、及预后[2]。另有报道，组织或培养的细胞受到放射线照射后，其bax基因表达上调，与其蛋白促进细胞凋亡有关[3]。我们在前期工作中发现，宫颈癌放疗前Bax高表达者的近期疗效优于低表达者[4]，郑建勇等[5]研究表明，bax基因高表达能够增加细胞对DNA损伤性药物阿霉素(adriamycin)的敏感性。因此，bax基因可能与DNA损伤引起的细胞凋亡有某种联系[6，7]，为此，我们采用人宫颈癌细胞Hela细胞系作为体外实验细胞，通过基因工程方法建立高表达bax基因的Hela细胞，旨在探讨其与放射线照射之间的关系。此外，还根据实验需要，将报告基因增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)基因通过内部核糖体结合位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)序列与bax基因串联起来，在同一个PCmv启动子下，启动两个基因的转录和表达，并且表达的两种外源蛋白互不干扰，保持原有活性。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂
pLXSN逆转录病毒表达载体、pIRES2EGFP真核表达载体均为BD ClonTech公司产品；DH5α大肠杆菌细胞、PA317包装细胞、Hela细胞、NIH 3T3细胞为山东大学齐鲁肿瘤中心实验室提供；Pfu、Taq DNA聚合酶为上海博亚公司（BioAsia）产品；EcoRⅠ、XhoⅠ、BamHⅠ等限制性内切酶为MBI产品；兔抗人Bax一抗、羊抗兔HRP标记IgG二抗为Santa Cruz公司产品；pMD18T载体为大连宝生物公司（TaKaRa Dalian）产品；其它试剂购自上海生物工程公司（Sangon）产品。
1.2 细胞培养
PA317细胞以DMEM培养基培养，Hela细胞以RPMI 1640培养基，置37oC、5%CO2环境下培养。培养基内含10%新生牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml。
1.3 实验技术路线
如图1所示。
1.4 引物设计
根据GenBank数据库（）得到bax基因cDNA序列（收录号：NM_138761）及其相关信息，采用Oligo 6.0软件设计bax引物，序列如下：上游P1 5′GAGAATTCATGGACGGGTCCGGGGAG 3′，下游P2 5′GTCTCGAGCCTCAGCCCATCTTCTTC3′，P1人为引入EcoRⅠ酶切位点，P2引入XhoⅠ酶切位点，其PCR扩增产物预计在597bp，包含bax基因整个开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）。另外，为了从pIRES2EGFP载体上引出IRES2EGFP基因序列，又设计了一对引物P3、P4和测序引物P5，序列如下：上游P3 5′GTATCTCGAGATTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′、下游P4 5′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′、P5 5′ATG GTGAGCAAGGGCGAGGAG 3′。P3引入XhoⅠ酶切位点， P4引入BamHⅠ酶切位点，扩增产物预计为1346 bp。
1.5 bax基因克隆及鉴定
采用异硫氰酸胍一步法从培养Hela细胞中提取总RNA，取1μg总RNA，按照MMLV逆转录酶操作说明书，转录成cDNA第一链，取2μl做模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，反应体系：P1、P2各0.5μM、2.5UPfu DNA聚合酶、200μM dNTP、1×PCR Buffer，50μl反应体系；反应条件：94oC预变性10min，94oC变性30s、52oC退火45s、72oC延伸60s共35个循环，再向PCR反应管中加入1.25U Taq DNA聚合酶，72oC终末延伸15min，使扩增产物5′端加A，以方便TA克隆。50μl PCR产物跑制备电泳，胶回收纯化PCR产物，按照pMD18T载体说明书进行TA克隆，转化感受态DH5α，涂布LB+Amp抗性平板，菌落PCR筛选、酶切初步鉴定阳性重组质粒pMDbax，然后用ABI BigDye 3.1测序试剂盒、M13通用引物做测序PCR，在ABI Prism 3100Avant遗传分析仪上做测序鉴定。
1.6 IRES2EGFP基因序列获得及鉴定
取10ng pIRES2EGFP载体做模板，P3、P4为引物进行PCR扩增，反应体系：P3、P4各0.5μM、2.5 U Pfu DNA聚合酶、200μM dNTP、1×PCR Buffer，50μl反应体系；反应条件：94oC预变性10min，94oC变性30s、60oC退火45s、72oC延伸90s共30个循环，再向PCR反应管中加入1.25 U Taq DNA聚合酶，72oC终末延伸15min。TA克隆、阳性重组质粒筛选、测序鉴定同上，除用M13通用引物外，还用P5引物测序，将1 346bp长度的DNA序列测通，将其重组质粒命名为pMDIRES2EGFP。
1.7 pLXSNIRES2EGFP表达载体构建及鉴定
用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切测序鉴定正确的pMDIRES2EGFP重组质粒，跑1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化1 350bp左右的条带，此为两端带XhoⅠ和BamHⅠ位点的IRES2EGFP基因序列。同样，用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切pLXSN载体质粒，胶回收纯化5.9kb的线性化的载体，其两端同样带有XhoⅠ和BamHⅠ位点。用DNA Ligation Kit将IRES2EGFP基因序列通过XhoⅠ和BamHⅠ位点定向与线性化的pLXSN载体连接，连接时其摩尔数之比控制在4:1左右。转化、筛选同上。最后XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。此载体命名为pLXSNIRES2EGFP。
1.8 pLBaxSNIRES2EGFP表达载体构建及鉴定
用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切测序鉴定正确的pMDbax重组质粒，胶回收纯化600bp左右的条带，此为两端带EcoRⅠ和XhoⅠ位点的bax基因序列。同样，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定过的pLXSNIRES2EGFP载体质粒，胶回收纯化7.2kb的线性化的载体，其两端同样带有EcoRⅠ和XhoⅠ位点。用DNA Ligation Kit将bax基因序列通过EcoRⅠ和XhoⅠ位点定向与线性化的pLXSNIRES2EGFP载体连接。最后EcoRⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ三酶切鉴定。此为bax基因的逆转录表达载体pLBaxSNIRES2EGFP。
1.9 逆转录病毒表达载体的包装及感染Hela细胞
按《分子克隆》碱裂解方法中量提取pLBaxSNIRES2EGFP质粒，用PEG8000方法再次沉淀纯化质粒，-20°C储存备用。收集PA317包装细胞至107左右在400μl培养基中，加入15μg的pLBaxSNIRES2EGFP质粒，在BTX 830电穿孔仪上做电转化，条件为：电压475V，脉冲时间1 ms，脉冲次数2，4mm电转杯。电转后补足培养基，37oC、5％CO2条件培养24h后，加G418至终浓度800μg/ml筛选，此浓度筛选2周后，挑选抗性克隆进行扩大培养，G418浓度降为200μg/ml。待其生长状态良好时，每隔48~72h收集病毒上清1次，收集重组病毒上清液以NIH 3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度。Hela细胞以105细胞传代，待其长满至瓶底的70%时，加入8μg/ml Polybrene的病毒上清1ml，均匀覆盖平瓶底，每隔30min轻摇1次，至2h加入新鲜完全培养液，使Polybrene浓度降至8μg/ml，48h后1:10传代并加入含有800μg/ml G418的培养液，3周后挑取抗性克隆扩增培养，G418浓度降低至200μg/ml。
1.10 Western Blotting检测bax基因的表达
收集扩增培养的克隆细胞，用细胞裂解液裂解细胞，12 000g、10min离心去除细胞碎片，Bradford方法测细胞裂解液的蛋白含量，取25μg总蛋白样品在12.5% SDSPAGE进行电泳分离，经电转膜仪转至硝酸纤维素膜。然后用5%脱脂奶粉4oC封闭4h，弃溶液，加入用5%脱脂奶粉稀释的兔抗人Bax抗体（1:500稀释），室温轻摇1h，TBST洗膜3次，加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化酶（HRP）偶联的羊抗兔IgG（1:5000稀释），室温轻摇1h，TBST洗膜3次后，用ECL方法显色，压片。AlphaImager2200软件成像、分析。SPSS 10.0分析实验组与对照组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。
2 结 果
2.1 bax基因克隆
以Hela细胞来源的cDNA为模板，P1、P2为引物，52oC退火PCR扩增，PCR产物在600bp左右有带（如图2），经纯化后TA克隆至pMD18T载体上，M13通用引物测序得到其序列，经NCBI数据库BLAST比对分析，得到的PCR产物序列完全与收录号为NM_138761的bax基因的cDNA序列完全一致，说明已经成功得到bax基因的cDNA序列。
2.2 bax基因逆转录病毒表达载体的构建
采用PCR方法，从pIRES2EGFP表达载体上扩增出来的IRES2EGFP序列经测序验证，与ClonTech公司提供的完全一致，后又通过XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点，定向与pLXSN载体连接，菌落PCR筛选后，提取阳性克隆质粒，用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切验证应该出现两条带，在1 300bp左右处有IRES2EGFP序列，在6 000bp左右处有pLXSN线性载体序列（如图2），阳性克隆命名为pLXSNIRES2EGFP。验证正确的bax基因通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，定向克隆至pLXSNIRES2EGFP载体，菌落PCR阳性克隆提取质粒后用EcoRⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ三酶切验证，琼脂糖电泳检测出现除了上述两条带外还有600bp左右的bax基因序列带（如图3所示），阳性克隆命名为pLBaxSNIRES2EGFP。说明已成功构建bax和EGFP的双基因表达的逆转录病毒表达载体。
2.3 外源bax基因的表达
将pLBaxSNIRES2EGFP载体通过PA317细胞包装后，病毒颗粒感染Hela细胞，同时以pLXSNIRES2EGFP载体作为对照，800μg/ml的G418筛选4周后，Western Blotting方法检测bax基因的表达，可见在总蛋白上样量一致的情况下，转有外源bax基因的实验组的Bax蛋白明显比对照组含量要高，表明外源bax基因成功在Hela细胞中表达。
3 讨 论
人bax基因全长6 939bp，定位于染色体19q13.3q13.4，由6个外显子组成，转录后可产生α、β、γ、δ、ε和σ 6种mRNA剪接变体，并分别编码产生6种Bax蛋白亚型[8]。Baxα是细胞中存在的主要形式并有生物活性的主要蛋白亚型。本实验的引物是根据Baxα的ORF的序列设计的，而Baxδ、ε和ζ的ORF同样包含有引物配对区域，因此，如果Baxα、δ、ε和σ四种蛋白亚型都有表达，PCR反应扩增基因时会出现4条大小不一的片段，分别为593bp、446bp、691bp和554bp。本实验结果只扩增出593bp的片段，最后测序证实为Baxα的cDNA序列，是bax基因在肿瘤细胞中的主要表达形式，与报道[1]相符。
报告基因对研究肿瘤的发生、、浸润、转移的分子机制提供了简便的观察方法，并在肿瘤的基因中作为活细胞的筛选标志，方便、省时、无毒副作用。GFP是一种被广泛应用的报告基因。GFP基因能在异源细胞中表达并且无细胞毒性，在活体内通过荧光显微镜就能清晰地观察到。但是目前作为标记基因应用较多的是GFP的增强型突变体EGFP，它的荧光波长发生偏移，发射出的荧光强度要比野生型大6倍以上，所以EGFP比野生型GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内的转运和定位等[9]。
本文根据基因工程原理将目的基因bax和报告基因EGFP通过IRES序列连接起来，两个基因在同一个启动子下转录成单链mRNA，但翻译时又是相互独立的，不会形成嵌合蛋白[10]，保证了Bax蛋白的生物活性，并且理论上只要有EGFP的表达，bax基因也肯定会表达，比同时共转染两个载体要方便，最重要的是能准确分析目的基因的表达情况，所以，只要通过荧光显微镜观测其EGFP有无表达，即可判断bax基因是否表达，简单易行。一般商品化的逆转录病毒表达载体只有一个多克隆位点，只能插入一个外源基因，本实验在现有基础上，通过IRES序列构建双基因表达的逆转录病毒表达载体，实验已证实此方法是可行的，并通过此方法成功建立了带有报告基因EGFP高表达Bax的Hela细胞株。
【文献】
[1] Oltvai ZN, Mlilliman CL, Korsmeyer SJ, et al. Bcl2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog Bax, that accelerates programmed cell death [J]. Cell, 1993,74(4):609-619.
[2] Sarbia M, Bittinger F, Grabellus F, et al. Expression of Bax, a proapoptotic member of the Bcl2 family, in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Int J Cancer, 1997,73(4):508-513.
[3] Tatsuya O, Takashi N, Yuzuru N, et al. Bax protein expression correlates with radiationinduced apoptosis in radiation therapy for cervical carcinoma [J]. Cancer, 1998,83(1):103-110.
[4] 乔乃安, 程玉峰, 刘宏, 等. 宫颈癌中细胞凋亡指数与放射治疗临床效果关系的研究[J].妇产科进展, 2002,11(3):191-193.
[5] 郑建勇, 李江, 王文亮, 等. bax基因的过表达上调HCC9204细胞系对阿霉素的敏感性[J]. 中华肿瘤杂志, 2002,24(4):335-338.
[6]Zhang L,Jian Y,Ben HP,et al.Role of BAX in the apoptotic response to anticancer agents [J]. Science, 2000,290:989-992.
[7] Warner KH,Jesus G, Waleed O, et al. BaxInduced apoptosis as a novel gene therapy approach for carcinoma of the cervix [J]. Gynecologic Oncology, 2001,83: 370-377.
[8] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene, GeneID:581.
[9]Jackson RJ, Howell MT , Kaminski A. The novel mechanism of initiation of picornavirus RNA translation[J]. Trends Biochem, 1990, 15:477-483.
[10] Hennecke M, Kwissa M, Metzger K, et al. Composition and arrangement of genes define the strength of IRESdriven translation in bicistronic mRNAs [J]. Nucleic Acids Res, 2001,29(16):3327-3334.
