不同条件下NK细胞在小鼠黑色素瘤内的浸润
作者：嵇晶晶，包颖兰，于常华，崔 凤，吕慧芳，徐玉清
【摘要】 目的 比较DC及IL?2，IL?15维持NK细胞体内活性的作用效果。 方法 DAPI标记的NK细胞输入负瘤小鼠体内，同时分别给予DC、IL?2及IL?15，不同时间取肿瘤组织，荧光显微镜及电镜观察；MTT法测NK杀伤活性。 结果 DC可增强NK杀伤活性，NK/DC为1∶1时NK细胞杀伤活性强于NK/DC为10∶1时(Ｐ<0.05)。肿瘤组织内NK分布呈时间及剂量相关性，DC组NK浸润数量多于IL?2组及IL?15组，但无明显差异(Ｐ>0.05)。结论 24小时内DC可维持并促进NK细胞活性，无需依赖外源性细胞因子。NK与DC的相互作用与剂量相关。
【关键词】 NK；DC；IL?2；IL?15；荧光显微镜
NK细胞（natural killer cell，NK）可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞,对宿主自身正常细胞无杀伤作用。细胞因子IL?2及IL?15可调节其杀伤及分泌功能。DC细胞（dendritic cell，DC）是机体内最强的抗原提呈细胞，可表达共刺激分子,分泌细胞因子,诱导初始免疫应答。NK细胞通过直接作用或生物信号间的协同作用活化DC，DC又可促进NK分泌功能，诱导CTL反应[1]，在肿瘤免疫中发挥重要作用。本研究通过比较IL?2, IL?15及DC与NK细胞的作用效果，寻求NK细胞在肿瘤免疫治疗中发挥最佳效应的适用途径。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
rhIL?2购自北京远策药业有限公司；rmIL?15，rmIL?4，rmGM?CSF购自英国Peprotech EC公司；Dynabeads M450?CD8购自美国Dynal Biotech公司；4，6?联脒?2?苯基吲哚DAPI，购自美国Sigma公司。
1.2 动物模型的建立
C57BL/6小鼠，雄性，18～22 g，8～12周龄（购自哈医大二院动物实验中心）。培养小鼠黑色素瘤细胞株B16（购自上海坤肯细胞库），小鼠背部皮下注射。
1.3 NK细胞的体外培养及标记
将C57BL/6小鼠处死，取出脾脏制成单细胞悬液，裂解红细胞，洗涤后置于RPMI1640培养基中，加rhIL?2至6 000IU/ml，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。第3天加入Dynabeads于4℃共同作用20 min，去除CD8＋细胞 [2]。加入新鲜RPMI1640培养基，隔日给rhIL?2。第6、7天加入DAPI 50 mg/ml于恒温培养箱中培养3 h后收集贴壁细胞备用。
1.4 DC的体外培养
将C57BL/6小鼠处死，取四肢骨骨髓制成单细胞悬液，裂解红细胞，洗涤后置于RPMI1640培养基中，加入10ng/ml rmGM?CSF，10ng/ml rmIL?4，于恒温培养箱中培养[3]。隔天半量换液，培养6～8天收集细胞备用。
1.5 MTT法测NK细胞杀伤活性
靶细胞为B16细胞。分四组：①NK细胞对照组；②NK＋IL?2（1 000IU/ml）组；③NK＋IL?15（10μg/ml）组；④NK＋DC组，NK与DC比分别为10∶1，1∶1，1∶10。效靶比5∶1，10∶1，20∶1，设立效应细胞对照孔（E），靶细胞对照孔（T），反应孔（E+T），每组设三个复孔，测定的OD值取三孔均值，按以下公式：
NK细胞杀伤活性（％）＝（1―ODE+T -ODEODT）×100％
1.6 黑色素瘤皮下模型内NK表达的测定
将5×106个DAPI标记的NK细胞通过鼠尾静脉注入负瘤小鼠体内，分别给予不同剂量的IL?2,IL?15及DC，于6h，12h，24h将鼠处死，取瘤组织，做冰冻切片，荧光显微镜下观察；部分经3%戊二醛固定电镜观察。
1.7 统计学分析
应用SPSS统计软件处理数据，采用t检验。
2 结果
2.1 NK细胞杀伤活性的比较
效靶比为20∶1时实验组NK细胞的杀伤活性均强于对照组。NK∶DC为1∶1时，杀伤活性较10∶1时有显著增强（Ｐ<0.05），而再加大DC的剂量杀伤率未见增强。NK∶DC为1∶1时NK杀伤活性较IL?2组及IL?15组有所提高，但无统计学意义（Ｐ>0.05），见表1。表1 NK细胞杀伤活性的比较
2.2 电镜观察结果
镜下肿瘤细胞周围可见NK细胞和DC细胞，见图1。DC表面有较多树突状突起，胞质内有溶酶体颗粒，细胞器较少，胞核形状不规则。NK表面有少量指状突起，胞质较多，细胞核呈卵圆形，核内染色质丰富，异染色质多分布在边缘。肿瘤细胞体积较大，约30～40μm，细胞表面可见密集分布的微绒毛，胞质内有较多的线粒体。图1可见DC的伪足正伸入瘤细胞体内，DC突起与瘤细胞质膜融合。靶细胞线粒体肿胀，胞质中出现空泡变性，核染色质破碎，最终溶解坏死。荧光显微镜下，肿瘤组织内可见淡蓝色荧光的DAPI标记的NK细胞，见图2。
2.3 NK细胞在肿瘤组织内的浸润与时间的相关性，见图3。NK细胞在肿瘤组织内的浸润呈时间依赖性。
图3 NK细胞在肿瘤组织的浸润与时间的关系
2.4 NK细胞在肿瘤组织内的浸润与剂量的关系，见图4。
图4 NK细胞在肿瘤组织内的浸润呈剂量相关性
3 讨论
NK细胞是大颗粒淋巴细胞，可与肿瘤细胞直接接触，通过穿孔素依赖机制介导靶细胞溶解坏死。在实验中观察到NK细胞可浸润到肿瘤组织内。有研究发现在肺、肝等脏器的转移瘤中也可见NK聚集，且要多于正常组织。Yang Qin[2]在实验中发现NK细胞在肿瘤组织内的浸润受到肿瘤组织形态的影响，疏松的肿瘤组织更适合于NK细胞的浸润。NK细胞静脉注入5天后，观察到肺转移瘤有所缩小。腹腔内注射NK细胞及PEG?IL?2可观察到腹腔内转移瘤较前缩小，而肺转移瘤则无明显变化。看来，NK细胞主要依赖于相互接触来识别并消灭靶细胞。
以往的研究认为，NK细胞的存活与活化需要依赖于细胞因子。长期培养的骨髓基质细胞上清中含有IL?15，而未检测到IL?2，故IL?2可能仅参与外周血NK细胞的发育，而IL?15极有可能是造血干细胞分化为NK细胞的天然调节因子[4]。那细胞因子的存在是NK细胞存活的必需条件么？我们的实验结果表明，无外源性细胞因子时DC可促进NK杀伤活性，观察24小时内，诱导NK细胞转移到肿瘤组织内，杀伤肿瘤细胞，且其作用效果与细胞因子相似。Ferlazzo等[5]将DC与外周血来源的NK细胞共同培养7天，发现NK细胞有增殖，而且检测到IFN?γ的分泌。将DC与IL?2激活的NK细胞共同培养，可得到类似结果。故将NK与DC共同培养，可维持并促进NK细胞活性，而无需依赖外源性细胞因子。
NK与DC共同培养，比例不同作用效果也不同。实验结果表明，NK与DC的低比率可增强DC细胞的功能，而大剂量NK反而抑制其相互作用。一方面，NK细胞分泌IFNγ可促进DC细胞成熟，另一方面，NK细胞可杀伤非成熟DC细胞(iDC)[6],其溶解杀伤作用受到NKp30受体的调解。故NK细胞与DC细胞按适当比例混合共同培养才可以发挥最佳免疫效应。
Kim发现与NK细胞共同培养时，肿瘤细胞致敏的DC细胞比未经处理的DC细胞分泌更多的IFNγ[7]，IFNγ在抗肿瘤反应中起重要作用。预先接种肿瘤细胞致敏的DC可激活NK细胞，引发CTL应答，抑制肿瘤细胞的转移。在去除NK细胞的负瘤小鼠体内接种预先致敏的DC，肿瘤细胞的转移未受抑制。由此可见，在DC引起的抗肿瘤免疫应答中，NK细胞是必不可少的，将NK与DC疫苗结合将是肿瘤免疫研究的一个新方向。（本文图1，2见插页2）
【】
［1］ Kalinski P, Mailliard RB, Giermasz A, et al. Natural killer?dendritic cell cross?talk in cancer immunotherapy/[J/]. Expert Opin Biol Ther, 2005, 5(10):1303?1315.
/[2/] Yang Q, Hokland ME, Bryant JL, et al. Tumor?localization by adoptively transferred, interleukin?2?activated NK cells leads to destruction of well?established lung metastasis/[J/]. Int J Cancer, 2003, 105(4):512?519.
/[3/] Son YI, Egawa S, Tatsumi T, et al. A novel bulk?culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells/[J/]. J Immunol Methods, 2002, 262(1?2):145?157.
/[4/] Vosshenrich CA, Ranson T, Samson SI, et al. Roles for common cytokine receptor gamma?chain?dependent cytokines in the generation, differentiation, and maturation of NK cell precursors and peripheral NK cells in vivo/[J/]. J Immunol, 2005, 174 (3): 1213?1221.
/[5/] Ferlazzo G, Tsang ML, Moretta L, et al. Human dendritic cells activate resting natural killer (NK) cells and are recognized via the NKp30 receptor by activated NK cells/[J/]. J Exp Med, 2002, 195(3):343?351.
/[6/] Vitale M, Della Chiesa M, Carlomagno S, et al. NK?dependent DC maturation is mediated by TNFalpha and IFNgamma released upon engagement of the NKp30 triggering receptor/[J/]. Blood, 2005, 106(2):566?571.
/[7/] Kim A, Noh YW, Kim KD, et al. Activated natural killer cell?mediated immunity is required for the inhibition of tumor metastasis by dendritic cell vaccination/[J/]. Exp Mol Med, 2004, 36(5):428?443.
