NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2裸鼠皮下移植瘤的抑制作用

                   作者：梅家转，郭坤元，吴远彬，周健, 魏红梅

【摘要】  目的 研究同种异体NK细胞对人鼻咽癌细胞（CNE2）裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法 PCR?SSP法检测CNE2细胞HLA?A、B、Cw表型、NK细胞KIR表型（选择3例健康者为试验对象），磁珠分离法分离NK细胞并进行体外培养扩增，LDH释放法测定NK细胞对CNE2细胞的体外杀伤活性。12只BALB/c裸鼠分为两组，每组6只，对照组裸鼠每只皮下接种1×106CNE2细胞，组裸鼠每只皮下接种1×106CNE2细胞，同时每只经尾静脉注入3×107NK细胞，观察两组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积变化、抑瘤率。结果 CNE2细胞表面HLA?A、B、Cw 表型为A2,24；B18,35；Cw4,7，3例健康者均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为(9.37±2.14)%、(27.14±1.82)%、(36.40±4.28)% and (54.67±2.80)%。对照组和NK细胞治疗组肿瘤出现时间分别为(10.00±2.68)d、(18.80±1.64)d，(Ｐ<0.01),成瘤率分别为100％（6/6）、83.33%（5/6），对照组和NK细胞治疗组裸鼠的瘤重分别为(2.22±0.09)g、(1.42±0.09)g，(Ｐ<0.01)，NK治疗组的抑瘤率为36.04%。肿瘤组织石蜡切片病鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌，NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞，较多的淋巴细胞浸润和大量细胞坏死区。结论 NK细胞对鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤有明显的抑制作用，有希望成为治疗鼻咽癌的新方法。

【关键词】  鼻咽癌；杀伤细胞；裸鼠；移植瘤；杀伤细胞免疫球蛋白样受体；细胞治疗

    鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤，早期患者采用放射治疗常能取得较好的治疗效果，晚期患者放射治疗联合化学治疗虽能提高局部控制率，但未能提高总体生存率[1]。异基因骨髓移植中供受者之间杀伤细胞免疫球蛋白样受体?配体错配(KIR?配体错配)引发的同种异体反应性NK细胞活性可以防止白血病细胞复发[2]，使NK细胞的抗肿瘤治疗作用日益得到医学研究者的重视。此前我们的体外实验表明同种异体NK细胞对CNE2细胞具有较强的杀伤活性[3]。本研究以同种异体NK细胞为效应细胞，观察其对人鼻咽癌细胞（CNE2）裸鼠皮下移植瘤生长的影响，为鼻咽癌的治疗探索一种新的方法。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    分离NK细胞用的缓冲液(磷酸盐缓冲液，pH7.2，加入0.5%BSA，2mmol/lEDTA，Miltenyi Biotec公司产品)，CD56 MicroBeads (Miltenyi Biotec公司产品)，RPMI 1640(Gibco公司产品)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品)，rhIL2、PHA (Sigma公司产品)，人鼻咽癌细胞株CNE2购于军事医学院。

    1.2  方法

    1.2.1  NK细胞的分离纯化  采用常规密度梯度离心法分离3例健康人外周血单个核细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，CD56 MicroBeads作MACS细胞阳性分选，获得CD3－CD56+细胞即为NK细胞。

    1.2.2  细胞培养  细胞培养基为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640。培养NK细胞时加入1 000U/ml rhIL?2，PHA 10μg/ml。

    1.2.3  CNE2细胞表面HLA?A、B、Cw基因分型  采用PCR?SSP法，按PCR?SSP?A、B、Cw特异性引物试剂盒说明操作。

    1.2.4  KIR基因分型  采用PCR?SSP法，按KIR基因分型试剂盒说明操作。

    1.3  动物实验 

    1.3.1  裸鼠  选取体重15～20g的4～6周BALB/c裸鼠12只，分2组，每组6只，雌雄各半，在第一军医大学SPF动物实验中心饲养。

    1.3.2  裸鼠接种  对数生长期的CNE2细胞经胰酶消化、离心收集、计数后重悬于无血清RPMI 1640培养基中，配制成每0.1ml含1×106个肿瘤细胞的悬液，用1ml注射器将0.1ml细胞悬液注射于BALB/c裸鼠背部皮下，NK细胞治疗组，NK细胞悬于无血清RPMI?1640培养基中计数，配制成每0.2ml含3×107个细胞的悬液，用1ml注射器将0.2ml细胞悬液经尾静脉注射于BALB/c裸鼠体内(每例健康者的NK细胞分别注射2只BALB/c裸鼠)，尾静脉注射NK细胞与皮下注射CNE2细胞同一天进行。

    1.3.3  肿瘤生长情况监测及肿瘤的病理变化观察  自细胞注射之日起，观察两组裸鼠成瘤时间、成瘤率，待肿瘤出现后用游标卡尺测量肿瘤块2个方向的直径,分别记为ａ、ｂ，肿瘤体积计算公式：V=1/2ab2[4]。肿瘤出现后3周处死裸鼠，测肿瘤重量,计算肿瘤生长抑制率：肿瘤生长抑制率＝(1-处理组肿瘤重量/ 对照组肿瘤重量)×100％[5] 。肿瘤标本称重后,常规福尔马林固定,石蜡包埋,5μm连续切片,分别行HE染色，观察病理变化。

    1.4  统计学方法

    应用SPSS10.0软件进行数据处理，数据以±s表示，采用独立样本t检验。

    2  结果

    2.1  NK细胞的纯度  流式细胞仪检测CD3－CD16+CD56+细胞的纯度为(91.23±0.85)%。

    2.2  CNE2细胞表面HLA?A、B、Cw基因分型结果  CNE2细胞表面HLA?A、B、Cw表型为A2, 24；B18,35；Cw4, 7。

    2.3  KIR基因分型  3例健康人均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。

    2.4  NK细胞对CNE2细胞的体外杀伤活性  效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分虽为（9.37±2.14)%、(27.14±1.82)%、(36.40±4.28)%和（54.67±2.80）%。

    2.5  肿瘤的生长情况  单纯接种CNE2细胞组和CNE2+NK细胞组，肿瘤出现时间分别为(10.00±2.68)d、(18.80±1.64)d，(Ｐ<0.01)，NK细胞治疗组成瘤时间较CNE2细胞组明显延长。

    2.6  NK 细胞抑制CNE2移植瘤的生长  实验结果表明NK细胞能有效抑制肿瘤细胞生长， 生长曲线显示NK细胞能明显减缓CNE2细胞BALB/c裸鼠体内移植肿瘤的生长速度，见图1。

    图1  NK细胞对CNE2移植肿瘤生长的影响

    2.7  各组裸鼠瘤重、抑瘤率  CNE2细胞组和CNE2+NK治疗组裸鼠的肿瘤重量分别为(2.22±0.09)g、(1.42±0.09)g ，(Ｐ<0.01)。NK细胞治疗组肿瘤抑制率为36.04％。

    2.8  肿瘤组织病理改变  成瘤组织经HE病理切片鉴定为低分化鳞状上皮细胞癌，细胞呈多边形，细胞核卵圆形或不规则形，核仁较明显，核分离相多见。NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞，较多的炎性细胞浸润和大量细胞坏死区，见图2。

    3  讨  论

    NK细胞是机体内重要的淋巴细胞亚群, 在肿瘤免疫中NK细胞构成了第一道杀伤防线。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(iKIR）与靶细胞表面特定的HLA I 类分子结合抑制NK细胞的活性，靶细胞缺乏iKIR特定的配体(KIR?配体错配)将激发NK细胞对靶细胞的杀伤活性[2]。不同的iKIR分子识别并结合不同的HLA I 类分子。KIR2DL1识别HLA?Cw2、Cw4、Cw5、Cw6；KIR2DL2/2DL3识别HLA?Cw1、Cw3、Cw7、Cw8；KIR3DL1识别HLA?Bw4；KIR3DL2识别HLA?A3，A11；其余的KIR配体尚未明确。KIR2DL1、KIR2DL2/2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2是目前已知的影响NK细胞同种异体反应性的主要抑制性受体[2]。

    本研究表明CNE2细胞表面HLA?A、B、Cw表型为A2，24、B18，35、Cw4，7，不表达Bw4、A3、A11分子，因此3例健康个体体内表达KIR3DL1、KIR3DL2的NK细胞与CNE2细胞之间存在KIR?配体错配现象。KIR3DL2为NK细胞的框架基因，任意个体的NK细胞均表达KIR3DL2[6]，因此任意个体的NK细胞均与CNE2细胞之间存在着KIR?配体错配现象。

    NKG2D是介导NK细胞杀伤活性的主要活化性受体，表达在所有NK细胞上，靶细胞表面的MICA/MICB分子是NKG2D的主要活化性配体，MICA/ MICB与受体NKG2D结合后可以激活NK细胞对表达MICA/MICB分子的肿瘤细胞的杀伤[7]。

    我们的研究[3]表明，CNE2细胞表面表达NK细胞活化性受体NK2D的配体MICA/MICB等，结合KIR检测结果表明，任意个体的NK细胞均存在杀伤CNE2细胞的分子基础，体外杀伤实验显示NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比30∶1时为(54.67±2.80)%。

    本研究中动物实验表明, NK细胞治疗组成瘤时间较CNE2细胞组明显延长，治疗组肿瘤体积较对照组明显减小，NK细胞治疗组肿瘤抑制率为36.04％，成瘤组织病证实两组均为低分化鳞状上皮细胞癌，NK细胞治疗组较对照组可见角化肿瘤细胞,有明显的淋巴细胞浸润和肿瘤坏死区，表明NK细胞能有效抑制CNE2移植瘤的生长。

    本研究提示NK细胞能有效抑制CNE2裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌的治疗提供了另一种方法，但尚需大规模的体内实验，为临床应用提供充分的依据。

【】
  ［1］ Chua DT, Sham JS , Au GK, et al. Concomitant chemoirradiation for stage Ⅲ?Ⅳ nasopharyngeal carcinoma in Chinese patients : results of a matched cohort analysis/[J/].Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2002, 53(2): 334?343.

/[2/] Hsu KC, Keever?Taylor CA, Wilton A, et al. Improved outcome in HLA?identical sibling hematopoietic stem?cell transplantation for acute myelogenous leukemia predicted by KIR and HLA genotypes /[J/]. Blood, 2005, 105(12): 4878?4884.

/[3/] 梅家转，郭坤元，魏红梅,等. NKG2D介导NK细胞对鼻咽癌细胞杀伤作用的体外研究/[J/]. 肿瘤防治研究,2007，34（4）：233?236.

/[4/] Vanhaesebroeck B, Mareel M, Van Roy F, et al. Expression of the tumor necrosis factor gene in tumor cells correlates with reduced tumorigenicity and reduced invasiveness in vivo/[J/]. Cancer Res,1991,51（8）: 2229?2238.

/[5/] Mivechi NF, Dewey WC. DNA polymerase alpha and beta activities during the cell cycle and their role in heat radiosensitization in Chinese hamster ovary cells /[J/]. Radiat Res, 1985, 103(3): 337?350.

/[6/] Ruggeri L, Capanni M, Mancusi A, et al. Alloreactive natural killer cells in mismatched hematopoietic stem cell transplantation /[J/]. Blood Cells Mol Dis, 2004, 33(3): 216?221.

/[7/] Pende D, Rivera P, Marcenaro S, et al. Major Histocompatibility Complex Class I?related Chain A and UL16?Binding Protein Expression on Tumor Cell Lines of Different Histotypes: Analysis of Tumor Susceptibility to NKG2D?dependent Natural Killer Cell Cytotoxicity/[J/]. Cancer Res, 2002, 62(21):6178?6186.