树突状细胞疫苗在人源化裸鼠体内的抗肿瘤免疫保护作用
作者：李保东，付泽娴，马云龙，薛平，蔡建辉
【摘要】 目的 探讨树突状细胞（DCs）疫苗在人源化裸鼠体内的抗胃癌免疫保护作用。方法 制备DCRNA疫苗；建立人源化裸鼠模型；15只人源化裸鼠随机分为DCRNA组、DCs组和PBS组，每组5只，分别用DCRNA、DCs和PBS皮下免疫注射2次，间隔1周，末次免疫后3天皮下接种胃癌细胞。各组裸鼠外周血人源性CD4﹢T细胞和CD8﹢T细胞的检测和观察GVHD反应。观察裸鼠瘤体积和瘤重。检测细胞因子IL?12和IFN?γ水平。结果 各组HuPBTL?裸鼠外周血中均检测到人源性CD4﹢T细胞和CD8﹢T细胞，无GVHD反应。DCRNA组瘤体积明显小于DCs组和PBS组（P＜0.05）；DCRNA组瘤重明显小于DCs组和PBS组（P=0.0452、P=0.0004），但DCs组和PBS组差异无统计学意义（P=0.0618）；DCRNA组抑瘤率（53.7%）显著高于DCs组（25.1%）（P＜0.05）。DCRNA组IL?12和IFN?γ水平明显高于DCs组和PBS组（P<0.05、P<0.01）。结论 HuPBTL腹腔注射，可成功构建裸鼠人细胞免疫功能；DCRNA疫苗在人源化裸鼠体内能诱导产生较强的抗胃癌免疫保护作用。
【关键词】 树突状细胞；疫苗；胃癌；裸鼠；人源化；细胞免疫
树突状细胞（Dendritic cells, DCs）是体内功能最强的抗原提呈细胞，在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫反应中起关键作用。近年来，国外DCs疫苗Ⅰ、Ⅱ期临床试验恶性胶质瘤[1]、肾癌[2]和结、直肠癌[3]等，说明DCs疫苗是安全可行的。我们前期的实验结果已经证实胃癌总RNA转染的DCs在体外诱导产生抗胃癌特异性CTL[4]，在此基础上，我们观察胃癌总RNA转染的DCs（DCRNA疫苗）在人源化裸鼠体内抗胃癌免疫保护作用。
1 材料和方法
1.1 材料
胃癌细胞株BGC?823，由河北医科大学申海涛博士惠赠。BALB/c（nu/nu）裸鼠购于医学院实验动物研究所，SPF级，4～5周龄，体重18～20g，均为雌性。饲养于河北省实验动物中心SPF级动物实验室，笼具、水和垫料均高压消毒，每3天更换1次。RPMI1640培养基购于美国Gibco公司，新生牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI1640完全培养基：以RPMI1640培养基为基础，加10%灭活的新生牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。重组人粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子（rhGM?CSF）、重组人白细胞介素?4（rhIL?4）均为美国Reprotech公司产品。TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司。Ficoll?Paque淋巴细胞分离液购于瑞典Amersham Biosciences公司。尼龙毛购于日本和光纯药株式会社。人IL?12和IFN?γ水平检测ELISA试剂盒为深圳晶美生物工程有限公司产品。FITC/PE标记鼠抗人单抗CD4、CD8购于美国BioLegend公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞BGC?823培养和胃癌总RNA的提取和鉴定 BGC?823常规培养、消化传代，取对数生长期细胞用于实验。消化、离心收集细胞，PBS洗涤3次，按TRIzol试剂盒说明书抽提胃癌总RNA，取少量RNA测定OD260/OD280，总RNA含量和纯度>1.8；琼脂糖变性电泳可见完整18S、28S两条带，表明总RNA完整未降解。调细胞BGC?823浓度为1×107/ml。
1.2.2 DCs的培养及DCRNA疫苗制备的健康成人外周血（肝素抗凝50U/ml）行密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMCs），PBS洗涤3次，在完全培养基，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养2h后，吸出未贴壁细胞；留下的贴壁细胞，流式细胞仪（FCM）检测其纯度（>90%），调整细胞密度为2×106/ml，加入6孔板中，每孔加完全培养基、rhGM?CSF100ng/ml和rhIL?4 50ng/ml，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养，隔天半量换液及添加rhGM?CSF和rhIL?4。[2]的方法，第5 天，将imDCs分成2组，1组imDCs用RPMI1640培养基调整密度为1×107/ml，加总RNA 50μg/ml，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中共培养60min进行转染，转染结束后更换培养基继续培养2天；另1组继续培养2天作为对照组。第7天收集全部悬浮和轻微贴壁细胞，PBS洗2次，调整其密度为5×106/ml。
1.2.3 人源化裸鼠模型的建立和DCRNA疫苗抗胃癌免疫保护作用 将吸出的非贴壁细胞，完全培养基悬浮后轻轻注入尼龙毛柱，37℃水浴1h，冲洗出非贴壁细胞即为人T淋巴细胞，FCM检测其纯度（93%），PBS洗涤2次，调整细胞密度为6×107/ml。15只裸鼠腹腔注射人T细胞3×107/只（0.5ml），建立HuPBTL?裸鼠模型。随机分为DCRNA组、DCs组和PBS组，每组5只，分别用DCRNA、DCs（1×106/0.2ml）和PBS 0.2ml皮下注射，免疫2次，间隔1周，末次免疫后第3天于裸鼠右腋窝中部外侧皮下接种胃癌细胞2×106/0.2ml。成瘤后每2天用游标卡尺测量瘤体最长径a、最短径b。观察各组裸鼠肿瘤生长速度、瘤体积和瘤重，TV=0.52×a×b2[5]，抑瘤率（%）[6]=（对照组平均瘤重?治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。
1.2.4 移植物抗宿主病（GVHD）反应和裸鼠人细胞免疫重建成功的检测 观察实验期间裸鼠的体重变化，有无皮疹、腹泻、步态改变等表现；实验结束时处死裸鼠，立即摘眼球将外周血置于含有EDTA的抗凝管中并混匀，FCM检测人源性CD4+T细胞和CD8+T细胞。
1.2.5 细胞因子IL?12和IFN?γ水平的检测 采用尼龙毛柱法分离免疫裸鼠的脾T淋巴细胞。以BGC?823细胞作为刺激细胞，加入50μg/ml的MMC，37℃，灭活30min。将T细胞和灭活的BGC?823细胞以10∶1混合，培养48h后收集上清液，采用ELISA法检测上清液中IL?12和IFN?γ水平。
1.3 统计学分析 实验数据用±s表示，应用SPSS13.0统计软件，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组裸鼠人细胞免疫重建成功的检测和GVHD反应
各组HuPBTL?裸鼠外周血中均检测到人源性CD4﹢T细胞和CD8﹢T细胞，见图1。各组裸鼠体重无明显变化，无皮疹、腹泻等。
2.2 不同组荷瘤鼠肿瘤体积、瘤重及抑瘤率的比较
DCRNA组瘤体积明显小于DCs组和PBS组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。DCRNA组瘤重（0.464±0.156）g明显小于DCs组（0.750±0.220）g和PBS组（1.002±0.138）g（t=2.371，P=0.0452；t=5.776，P=0.0004），但DCs组和PBS组差异无统计学意义（t=2.170，P=0.0618）；DCRNA组抑瘤率（53.7%）明显高于DCs组（25.1%），差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 细胞因子IL?12和IFN?γ水平的检测
DCRNA组IL?12和IFN?γ水平明显高于DCs组和PBS组，见表1。表1 各组细胞因子IL?12和IFN?γ水平的比较注：*与PBS 组比较t=13.23、P＜0.0001；▲与DCs组比较t=3.517、P=0.0079；#与PBS 组比较t=12.00、P＜0.0001；△与DCs组比较t=2.994、P=0.0172
3 讨论
裸鼠先天缺乏细胞免疫，为解决研究人体肿瘤免疫的动物模型不能确切反映人体免疫系统的这个问题，我们借鉴了建立HuPBL?SCID鼠嵌合体模型的经验[7，8]，腹腔注射人外周血T淋巴细胞（HuPBTL）以重建裸鼠的细胞免疫，建立人源化裸鼠模型，即HuPBTL?裸鼠嵌合体，较好地模拟了人体的免疫微环境。鉴定裸鼠体内人细胞免疫重建成功的最简单方法是FCM检测裸鼠外周血或淋巴器官（如脾）人源性T细胞特异性标记CD3﹢T细胞或其亚群CD4﹢T细胞和CD8﹢T细胞[7]。本实验各组裸鼠外周血中均检测到人源性CD4﹢T细胞和CD8﹢T细胞，提示腹腔注射HuPBTL可在裸鼠体内成功重建人的细胞免疫系统，且未发现GVHD。随着DCs疫苗策略的不断改进，有必要对疫苗进行临床前动物实验以评价其有效性和安全性，HuPBTL?裸鼠嵌合体模型的建立为DCs疫苗研究和在同一系统内比较、评价疫苗疗效奠定了实验基础。
移植瘤可激活SCID鼠内重建的人免疫系统发生抗肿瘤免疫应答，疫苗有助于免疫反应[7]。本实验结果显示，DCRNA疫苗组荷瘤鼠皮下移植瘤与DCs组和PBS组相比，其生长速度明显减慢，抑瘤率明显大于DCs组，提示重建的人细胞免疫系统已在裸鼠体内发生了抗肿瘤免疫应答，抑制移植瘤生长，DCRNA疫苗对胃癌生长有明显的抑制作用，能增强荷瘤鼠的抗肿瘤免疫应答。这是由于转染胃癌总RNA的DCs（DCRNA疫苗）成熟度增高，能更有效地将肿瘤抗原提呈给T细胞，激活肿瘤特异性CTL具有杀伤作用，有利于清除肿瘤细胞或远处器官的微转移[9]，同时CTL具有记忆效应，再次接触同种抗原时大量活化扩增，能有效抵抗胃癌细胞攻击。DCRNA疫苗免疫的裸鼠，其IL?12和IFN?γ水平明显增加，而且IL?12有较强的杀伤肿瘤细胞和抗肿瘤转移的作用[10]。DCRNA疫苗对人胃癌有较强的免疫保护作用，可能是特异性免疫和非特异性免疫共同作用的结果，为DCRNA疫苗应用于胃癌免疫预防的临床研究和预防胃癌术后复发、转移提供了实验依据。
【】
［1］ Caruso DA, Orme LM, Neale AM, et al. Results of a phase I study ulilizing monocyte?derived dendritic cells pulsed with tymor RNA in children and youth adults with brain cancer/[J/]. Neuro?oncol, 2004, 6(3): 236?246.
/[2/] Su Z, Dannull J, Heisra, et al. Immunological and clinical responses in metastatic renal cancer patients vaccinated with tumor RNA?transfected dendritic cells/[J/]. Cancer Res, 2003, 63(9): 2127?2133.
