槲皮素联合川芎嗪对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用

             作者：符慧群，李杰平，贺兼斌，张平

【摘要】  目的 探讨槲皮素联合川芎嗪对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用及其机制。方法 复制C57BL小鼠Lewis肺癌模型，将40只接种Lewis肺癌的C57BL小鼠随机分成4组：对照组（A组）、槲皮素组（B组）、川芎嗪组（C组）、槲皮素+川芎嗪组（D组），每组10只。连续用药20日，观察移植瘤生长情况，于接种后第22天处死各组小鼠，采用免疫组化半定量检测肿瘤组织微血管密度（MVD）、血管内皮生长因子（VEGF）及增殖核抗原（PCNA）的表达水平，用原位凋亡TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数（AI）。结果 （1）B、C、D组肿瘤的生长明显受到抑制，瘤重明显低于A组，其抑瘤率分别为39.87%、35.45%、54.58%，D组抑瘤率明显高于B、C组，差异有显著性（P<0.05）。（2）B、C、D组MVD、VEGF及PCNA表达水平明显低于A组（P<0.05或0.01），尤其是D组表达最低。B、C、D组AI较A组增高（P<0.05或0.01），D组最高。结论 槲皮素与川芎嗪联合用药可明显抑制Lewis肺癌移植瘤的生长，其作用机制与抑制微血管生成、抑制细胞增殖和促进细胞凋亡有关。

【关键词】  槲皮素；川芎嗪；Lewis肺癌；血管内皮生长因子；凋亡

　　Abstract：Objective  To explore the inhibitor effect and its mechanism of  quercetin combination  with tetramethylpyrazine on growth of lung carcinoma in mice. Methods  The Lewis lung carcinoma models of C57BL mice were establish. Forty C57 BL mice were randomly divided into 4 groups: control group(Group A)，quercetin group (Group B)， tetramethylpyrazine group(Group C) and quercetin +  tetramethylpyrazine group(Group D).Different treatments were served from day 2 after transplantation and all mice were sacrificed after 22 days. The volumes of tumors were measure respectively during the therapy time；subcutaneous tumors were processed for histological examination. The expression of microvessel density (MVD), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected by immunhistochemical method. The apoptosis index (AI) was measured by biotinyated ?dUTP nick and labeling (TUNEL). Results  （1）The tumor growth was suppressed significantly in Group B,C and D. The weights of tumor were markedly decreased in Group B,C and D compared with Group A. Group B,C,D had a growth inhibition rate of 39.87%，35.45% and 54.58% respectively.（2）The expression levels of VEGF，MVD and PCNA  were significantly lower in Group B, C, D than group A. AI was enhanced in Group B,C,D，compared with Group A. Conclusion  Quercetin combination with tetramethylpyrazine can remarkably inhibit the growth of Lewis lung carcinoma in mice, and its mechanisms might be relative to inhibiting the angiogenesis and tumor proliferating and inducing apoptosis.

　　Key words：Quercetin；Tetramethylpyrazine；Lewis lung carcinoma；Vascular endothelial growth factor；Apoptosis 

　　0  引言

    肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，其发病率和死亡率都有明显增高的趋势，迄今尚无有效的方法。近年来，从中药及天然植物中提取毒副作用低的抗肿瘤的有效成分，已成为肿瘤治疗的新途径。槲皮素是天然黄酮类化合物，体外实验证实对白血病、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌等有抑制作用[1，2]。新近研究发现川芎嗪对肺癌新生血管有较强抑制效应[3]。因此，本实验研究槲皮素联合川芎嗪对小鼠Lewis肺癌生长的影响，并探讨其可能的机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  药品与主要试剂 

　　盐酸川芎嗪注射液（TMP，40mg/2ml，批号9803161）购于无锡市第七制药厂，丙二醇（分析纯）为重庆东方试剂厂生产，槲皮素购于美国Sigma公司，TUNEL凋亡检测试剂盒、兔抗鼠PCNA单抗及SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，VEGF兔抗鼠单抗购于美国Santa Cruz生物科技公司，CD34兔抗鼠一抗、DAB显色剂均购自福州迈新生物工程公司。

　　1.2  模型制备与分组给药 

　　取接种Lewis肺癌10～14d的C57BL荷瘤小鼠（购自院上海药物研究所），脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织，按肿瘤质量（g）与生理盐水（ml）1∶3制备匀浆液备用。另取C57BL小鼠（购自中国医学科学院动物繁殖所）40只，雌雄各半，体重18～20g，每只小鼠于右腋皮下接种匀浆液，每只0.2ml，建立小鼠皮下肿瘤动物模型。40只小鼠皮下移植处均成瘤，接种2d后随机分成4组，每组10只。对照组（A组）：予丙二醇0.2ml+生理盐水0.2ml腹腔注射，1次/d；槲皮素组（B组）：予槲皮素50mg/kg溶于0.2ml丙二醇+生理盐水0.2ml腹腔注射，1次/d； 川芎嗪组（C组）：予川芎嗪100mg/kg溶于0.2ml生理盐水+丙二醇0.2ml腹腔注射，1次/d；槲皮素+川芎嗪组（D组）：予槲皮素50mg/kg溶于0.2ml丙二醇+川芎嗪100mg/kg溶于0.2ml生理盐水腹腔注射，1次/d。各组均连续给药20d，第22d处死全部小鼠进行指标检测。

　　1.3  一般检测 

　　接种前和接种后每2d称1次体重，按体重变化调整给药。接种后每2d测量1次小鼠皮下肿瘤最长径（a）和最短径（b），肿瘤体积（V= a×b2/2），绘制肿瘤生长曲线。第22d脱颈椎处死小鼠，完整剥离肿瘤称重，计算抑瘤率，抑瘤率=（1-治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100%。

　　1.4  HE及免疫组化染色 

　　取肿瘤组织，10%中性甲醛固定、石蜡包理，5μm连续切片，HE染色，光镜观察。采用免疫组化SABC法检测血管内皮生长因子（VEGF）、增殖核抗原（PCNA）及肿瘤组织微血管密度（MVD）的表达，严格按照试剂盒说明书进行操作，阴性对照用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。VEGF的判定标准：高倍镜下计数100个细胞，肿瘤细胞胞浆及胞膜中呈棕黄色阳性细胞<10%为阴性，≥10%阳性，采用全自动图像分析系统测定肿瘤组织中VEGF的平均灰度值(灰度值越低，其蛋白质表达越高)。PCNA结果，以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,选择阳性细胞密集区域，排除坏死区，每张切片计数10个高倍视野中阳性细胞数及细胞总数，计数增殖指数SPF。MVD的判定标准，凡与临近的肿瘤细胞、微血管或结缔组织分开的，呈棕黄色CD34染色的单个内皮细胞或内皮细胞串计为一个血管，但肌层较厚，或管腔面积>8个红细胞直径的血管不计数。MVD计数Weidner等[4]方法。

　　1.5  肿瘤细胞凋亡 

　　用TUNEL原位凋亡法检测，方法步骤按试剂盒说明书进行，用已知的阳性片为对照。细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,结果判断同PCNA，凋亡指数(Apoptosis Index,AI)。

　　1.6  统计学处理

　　所有数据用±s表示，采用组间t检验，多样本均数间多重比较的方差分析及q检验，数据分析采用SPSS10.0统计软件完成，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  药物对肿瘤生长的影响

    接种后，成瘤率为100%。各组皮下移植瘤的体积逐渐增大，肿瘤成局部结节状生长，接种后的第1～2d，移植瘤生长基本相同，第16～22d，对照组移植瘤生长明显快于其他组，联合组肿瘤生长最慢。各用药组对移植瘤生长均有抑制作用，以联合用药组更为明显。第22d后，各用药组肿瘤体积及瘤重均低于对照组（P<0.05），见表1。表1  药物对移植瘤生长的影响(略)注：A：对照组，B：槲皮素组，C：川芎嗪组，D：槲皮素+川芎嗪组；与A组比较*P<0.05，#P<0.01，与D组比较$P<0.05

　　2.2  移植瘤组织病观察

    移植瘤呈圆形、椭圆形或分叶状生长，质地硬，切面灰白，大部分与周围组织分界清楚。镜下移植瘤细胞形状不规则，大小不一，核大，浓染，核异形性明显，可见病理性核分裂相，核质比例明显增大，并可见血管增生，以间质及肿瘤边缘为主。各组内均可见组织坏死区，A组相对较少。B、C、D组癌细胞出现不同程度的退变，可见明显的坏死区，C、D组间质中血管成分明显减少。

　　2.3  药物对VEGF、PCNA、MVD表达及凋亡的影响表2  各组VEGF、MVD、PCNA表达和凋亡指数(±s)比较（略）注：与A组比较*P<0.05#P<0.01，与D组比较$P<0.05

    VEGF主要表达于肿瘤细胞的胞浆及胞膜中，血管内皮细胞也见表达，呈棕黄色颗粒。B、C、D组与对照组比较VEGF表达明显减少，差异有显著性（P<0.01），D组VEGF表达水平较C、D组降低（P<0.05）。所有肿瘤组织内MVD均阳性表达，内皮细胞被染成棕黄色。D组与其他组相比MVD显著减小（P<0.05）。PCNA表达于细胞核内而呈棕黄色颗粒，A组绝大多数细胞核染成棕黄色，PCNA增殖指数明显高于其他组（P<0.05），D组PCNA增殖指数最低，与B、C组相比有显著性差异。TUNEL染色凋亡细胞核亦呈棕黄色染色、未凋亡的细胞核呈蓝绿色。B、C、D组凋亡指数较A组明显增高（P<0.01），尤其以D组凋亡指数最高。

　　3  讨论

    实体瘤的生长和转移离不开新生血管的形成，新生血管为肿瘤细胞增殖提供营养代谢的同时，也促进原发肿瘤的生长和播散，而血管生成的核心是血管内皮细胞的增殖，VEGF作为一种最重要的血管生长因子在血管生成中起中心作用，它特异性地促进血管内皮细胞分裂、增殖和迁移，诱导微血管形成，增加血管通透性[5,6]。已有研究证明，多数肿瘤细胞都表达高水平的VEGF，抑制VEGF可有效抑制肿瘤的生长和转移[7]。本实验结果显示，对照组VEGF高度表达，且在癌肿浸润的边缘表达更为明显，与MVD表达有一致性，表明Lewis肺癌在生长过程中高表达VEGF，并形成了丰富的新生血管，从而促进了肿瘤的生长和转移。当用药后，VEGF和MVD的表达降低，其中以联合组降低最为明显，提示槲皮素联用川芎嗪在体内能明显地下调VEGF的表达，抑制肿瘤内血管形成，从而抑制肿瘤的生长与转移。

    PCNA是一种36KD的在细胞周期G1/S期合成的核蛋白，系DNA聚合酶的辅助蛋白，对DNA复制过程起重要作用，在非分裂细胞中合成量很少而在增殖状态的细胞和转化细胞中其合成量明显增加，已经证实PCNA的表达与细胞的增殖状态密切相关，有研究表明它是评估肿瘤预后的重要指标［8］。本研究发现，对照组PCNA表达最高，提示肿瘤细胞增生活跃，各用药组PCNA表达明显减少，尤其以联合组表达最低，与槲皮素组及川芎嗪组相比，差异均有显著性，证明各药都有可能通过抑制肿瘤细胞增殖而发挥抗肿瘤作用，而二药联用抑制肿瘤增殖的作用明显优于单一用药。本研究还发现，各用药组都能显著提高肿瘤细胞的凋亡指数，而以联合用药组提高更明显，说明槲皮素和川芎嗪都能促进肿瘤细胞凋亡，而联合应用则促凋亡作用进一步增强，并且说明具有不同抗癌机制的药物联合应用有增强抗癌活性的效果。

    本实验过程中，各组均未见明显不良反应，且联合用药组移植瘤的生长速度与其他各组比较明显减慢，最后的肿瘤重量和体积明显减少，抑瘤率明显高于其他组，提示槲皮素和川芎嗪具有抑瘤效果好而毒副作用小的优点，两者联合应用有协同作用。因此，槲皮素联合川芎嗪不失为一种疗效较好而毒副作用低的方案，有待于进一步研究

【】
  　　［1］Motoh M,Takahashi M,Fukuda K,et al.Suppression by flavoids of cyclooxygenase?2 promoter?dependent transcription activity in colon cancer cells:structure?activity relationship［J］. Jpa J Cancer Res,2000,91(7):686?691.

　　[2] Nguyen TT, Tran E, Nguyen TH, et al . The role of activated MEK?ERK pathway in quercetin?induced growth inhibition and apoptosis in A549 lung cancer cell［J］. Carcinogenesis, 2004, 25(5):647?659.

　　［3］陈刚，徐晓玉，严鹏科，等. 川芎嗪和丹参对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用与抑制血管生成的关系［J］.中草药，2004，35（3）296?299.

　　［4］Weidner N, Tumor angiogenesis: Review of current application in tumor prognosis［J］. Semin Diagn pathol ,1999,10(4):302?313.

　　［5］Kwak BK, Shim HJ, Park ES, et al.Hepatocellular carcinoma:correlation between vascular endothelial growth factor level and degree of enhancement by multiphase contrast?enhanced computed tomography［J］.Invest Radiol,2001,36(8):487?492.

　　［6］陈公琰，洪璇. 血管内皮生长因子与肺癌的关系［J］.中华肿瘤杂志,2005,27(8):449?451.

　　［7］Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis［J］. Kidney Inter,1999,56(8):794?814.

　　［8］AL?Sheneber IF, Shibata HR, Sampalis J, et al.prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer［J］.Cancer,1993,71(6)：1954?1959.