survivin及 bcl?2基因表达在胃癌细胞株MGC803顺铂耐药中的作用
【摘要】 目的 探讨胃癌细胞株MGC803对顺铂（CDDP）耐药产生的有关机制。方法 观察不同浓度CDDP(0.1、1.0、10.0mg/L)对MGC803细胞增殖、凋亡及抗凋亡基因survivin，bcl?2 mRNA表达的影响，用MTT法检测细胞生长抑制率；荧光染色检测细胞凋亡率；流式细胞仪测定细胞周期的变化；RT?PCR检测survivin、bcl?2 mRNA的表达。 结果 10mg/L的CDDP对MGC803细胞有较强的抑制增殖、促进凋亡作用，而0.1、1.0mg/L的CDDP干预24h后，其抑制细胞增殖，促进细胞凋亡的作用逐渐消失；CDDP作用于细胞48h后，细胞S期增加，G2/M期下降；MGC803细胞在1.0mg/L的CDDP作用下，survivin mRNA表达自24h后逐渐增高，bcl?2 mRNA表达逐渐下降(P＜0.05)。结论 CDDP可干扰MGC803细胞周期，但该细胞对低浓度CDDP易于产生耐药，survivin mRNA表达增高可能是MGC803细胞对CDDP产生耐药原因之一。
【关键词】 胃癌细胞株 顺铂 耐药 细胞凋亡 survivin bcl?2
胃癌是我国常见的恶性肿瘤，其死亡率居各类恶性肿瘤之首，化疗作为胃癌的重要手段之一，其疗效仍不令人满意，原因主要与癌细胞耐药有关。为此，本实验参照[1], 将胃癌常用化疗药物顺铂（Cisplatin,CDDP）设为三个不同作用浓度，通过检测MGC803细胞在顺铂作用过程中细胞周期，细胞增殖、凋亡及凋亡相关基因survivin、bcl?2 mRNA的表达变化，探讨胃癌细胞对细胞毒性药物顺铂耐药的产生及可能机制。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
RPMI 1640培养液，Trizol（GibcoBRL公司）；小牛血清（杭州四季青公司），四噻唑蓝（MTT）、溴已定（EB）、丫啶橙（AO）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司），survivin、bcl?2引物[2](上海生工合成)；β?actin（上海瑞科公司）；二步法RT?PCR试剂：Taq酶、oligo?dT、dNTP、DEPC（Sangon公司），M?NLV、Rnasin（Promeg公司），CDDP（山东齐鲁制药厂，生理盐水溶解，培养液稀释）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及传代
人胃低分化腺癌细胞株MGC803购自湘雅医学院细胞中心。细胞于含青霉素100U/L，链霉素100mg/L，10％灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中,置37℃，5％ CO2培养箱内培养。
1.2.2 MTT比色法测定药物对细胞增殖的影响
以5×103/孔接种MGC803细胞于96孔培养板，设3个复孔，实验组加CDDP处理，使终浓度分别达0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L，对照组加生理盐水，共同孵育12、24、48、72h，加20μl的MTT，继续培养4h，弃上清，加150μl的DMSO，酶联免疫检测分析仪测定570nm处的吸光值A570nm，并该浓度下的抑制率＝[(对照组A570nm -试验组A570nm)／对照组A570nm]×100％。
1.2.3 荧光显微镜检测各组药物对细胞凋亡的作用
MGC803细胞加CDDP处理，使终浓度分别达0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，作用12、24、48、72h，设3个复孔,收集细胞离心，弃上清，PBS洗3次，制成细胞悬液，加入终浓度均为100μg/ml的AO、EB，混匀，于显微镜下计数至少200个细胞的凋亡比率。早期凋亡细胞核染色质着绿色，呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞核染色质着桔红色，呈固缩状或破裂状；坏死细胞核染色质着桔红色，呈正常细胞结构；活细胞核染色质着绿色，呈正常细胞结构[3]。
1.2.4 流式细胞仪检测各组药物对细胞周期的影响
MGC803细胞加CDDP处理，使终浓度达0.1mg/L、1.0mg/L、10.0mg/L，对照组加生理盐水，共同作用48h,常规消化细胞，离心，PBS洗2次，每管加入70％的冰乙醇1～1.5ml，使每个样品含细胞数至少1×106个，－20℃固定送检流式细胞。
1.2.5 RT?PCR法检测CDDP干预前后survivin、bcl?2 mRNA表达变化
总RNA的制备：MGC803细胞接种于6孔板，试验组加CDDP处理，使终浓度达1.0mg/L，对照组加生理盐水，设3个复孔，采用Trizol法提取药物干预前及干预12、24、48、72h细胞总RNA。
RNA逆转录：按M?MLV说明书进行，cDNA置－20℃保存备用。
PCR扩增：反应体系包括10×Taq Buffer5μl，25mM/L MgCl23μl，10mM DNTP1μl，10pmol/μl的目的基因上、下游引物(survivin上游引物: 5'?CAG ATT TGA ATC GCG GGA CCC ?3', 下游引物: 5'?CCA AGT CTG GCT CGT TCT CAG ?3'; bcl?2上游引物: 5'?GTG GAG GAG CTC TTC AGG GA ?3', 下游引物: 5'? AGG CAC CCA GGG TGA TGC AA ?3')、β?actin上、下游引物各2μl，cDNA模板4μl，2.5U/μl Taq酶1μl，补充DEPC水至50μl。置PCR扩增仪上扩增，95℃预变性5min，变性、退火、延伸分别为94℃30s、X℃（survivin为61℃、bcl?2为59℃）1min 、72℃1min，30个循环后72℃终末延伸10min。PCR产物用含0.5mg/Lde1的EB琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪分析结果，计算目的基因与相应β?actin的比值。
1.3 统计学处理
定量及半定量资料,用均数±标准差表示， SKN?q检验进行统计分析。
2 结果
2.1 MTT比色法测定各浓度CDDP对胃癌细胞增殖的影响
各复孔平均吸光值结果发现,高浓度CDDP（10.0mg/L）组随时间的延长，细胞增殖降低明显(P＜0.05)；而低浓度(0.1mg/L、1.0mg/L)CDDP组在作用24h后不再明显下降，说明MGC803细胞对低浓度CDDP抑制增殖作用易产生耐受，见表1。表1 CDDP 对MGC803细胞增殖的影响实验组与CDDP处理前比较，*P<0.05,**P<0.012.2荧光染色检测各组CDDP对胃癌细胞凋亡的影响
荧光染色计数凋亡细胞发现，高浓度的CDDP（10.0mg/L）作用后，细胞凋亡率随作用时间的延长而增加(P＜0.05),见图1,而低浓度的CDDP（0.1mg/L,1.0mg/L）作用于MGC803细胞24h后，细胞凋亡率几乎不再发生改变，表2。表2CDDP对 MGC803细胞凋亡的影响表达变化（bcl?2 mRNA 304bp,β?actin 500bp）
2.3流式细胞检测各组CDDP对胃癌细胞周期的影响
MGC803细胞经不同浓度的CDDP作用48h后，细胞S期比率逐渐增加，G2/M期下降。CDDP对细胞周期的影响具有明显的量效依赖关系,见表3。表3 CDDP对 MGC803 细胞周期的影响
2.4RT?PCR检测CDDP对胃癌细胞survivin、bcl?2 mRNA表达的影响
RT?PCR检测survivin、bcl?2 mRNA表达的变化(图2、3)、凝胶成像分析仪分析结果(表4)发现，MGC803细胞在低浓度（1.0mg/L）CDDP作用下，survivin mRNA在24、48、72h后表达持续增强，72h后其表达接近于对照组的3倍。而 bcl?2 mRNA在干预12、24、84、72h表达逐渐减弱。表4 半定量RT?PCR检测CDDP 对 MGC803细胞
3讨论
临床上由于大剂量化疗药物毒副作用大，患者不能耐受，小剂量极易产生耐药等原因，极大地影响了其疗效。积极探索肿瘤细胞对化疗药物的耐药机制，克服肿瘤细胞耐药的产生，是胃癌非手术急需解决的问题之一。
survivin广泛表达于机体胚胎及恶性肿瘤组织 [4,5]，它在胃癌病理组织中表达高达82%[6]，而在正常组织、终末分化组织中表达阴性，同时survivin表达情况与肿瘤组织的转移、浸润及化学耐药等恶性生物学行为密切有关[7]，其作用机制与IAP家族的其他蛋白相似，它通过抑制caspase?3和7酶原的活性，从而抑制细胞凋亡，此外，survivin还参与了细胞的有丝分裂，促进细胞增殖，研究发现，应用survivin反意寡核苷酸抑制正常和肿瘤细胞survivin的表达，结果在细胞凋亡增加的同时，多倍体产生增多，软琼脂培养基中的集落减少[8]，转染survivin基因的293细胞增殖速度加快[9]，表达磷酸化缺陷survivin突变体可以增加人类黑色素瘤细胞的凋亡，增强顺铂诱导的细胞死亡[10]。bcl?2是较早发现的、重要的细胞凋亡抑制基因，在多种恶性肿瘤组织过度表达，它通过阻止钙离子从内质网向胞浆释放，使依赖钙离子的核酸内切酶活性降低，抑制氧化自由基的产生等阻断细胞凋亡，增加肿瘤播散侵袭能力。在本实验中发现，MGC803细胞存在凋亡抑制基因survivin和bcl?2 mRNA的表达。
CDDP可使肿瘤细胞周期发生改变，从而诱导周期特异性细胞凋亡[11，12]，我们的研究发现，MGC803细胞经CDDP处理后，细胞S期比例增加，G2/M期下降，说明细胞受阻于S期，不能进入G2/M期，这与有关对食管癌的研究报道相一致[13]。然而其临床疗效却不十分乐观，主要原因与肿瘤细胞的耐药有关，结果表明，大剂量CDDP（10.0mg/L）可抑制胃癌细胞株MGC803增殖、诱导凋亡，并具有较好的时效相关性，但该浓度已远远大于临床用药剂量，临床最大用药剂量的血药峰值浓度为2mg/L[14]，而接近这一浓度的低浓度组（0.1mg/L,1.0mg/L）对此胃癌细胞系作用较弱，药物干预24小时后，细胞凋亡率几乎不再发生改变，对细胞增殖抑制作用也逐渐减弱，表明MGC803细胞对低浓度CDDP极易产生耐药，其机制目前尚不十分清楚。除了肿瘤细胞能过度表达mdrl编码的P糖蛋白,增加药物排出外，还在于肿瘤细胞能抵抗药物诱导的凋亡。有研究认为，化疗药物接触肿瘤细胞后可诱导肿瘤细胞COX?2表达增加,进而诱导抗凋亡基因bcl?2的表达[15]，此外，新近研究还发现，CDDP可诱导凋亡抑制基因家族（IAP）的新成员survivin的表达增加[16，17]。本研究发现，MGC803细胞经低浓度（1mg/L）CDDP作用后，survivin mRNA于干预后24、48、72h表达逐渐增强，72h接近于对照组的3倍，Ikeguchi等报道了用小剂量CDDP（0.1mg/L, 1mg/L）作用于胃癌细胞系MKN?45后，早期（1h）细胞凋亡明显增加，干预后期（48h）凋亡细胞百分比不再发生变化，细胞survivin mRNA及蛋白表达均明显增加，其报道与本研究结果相一致。CDDP诱导凋亡的机制与Caspases?3的活化有关，而survivin则是通过抑制Caspases?3的活化而抑制细胞凋亡的，由此认为survivin的表达增加可抵抗CDDP诱导的细胞凋亡，产生耐药[16?18]，bcl?2 mRNA表达在CDDP干预后,逐渐下降，表明其表达受到CDDP的抑制，这一结果与部分报导不一致，其原因可能与使用的肿瘤细胞不同有关，文献认为bcl?2表达增高是由于肿瘤细胞在CDDP作用下经COX?2受体介导所致，而胃癌MGC803细胞株COX?2蛋白表达阴性。
结果证实低浓度CDDP可诱导胃癌细胞株MGC803 survivin mRNA表达增强，这一凋亡相关基因的改变，可能是导致胃癌细胞对化疗药物产生耐药的原因之一，而在这一过程中bcl?2的作用似乎不明显。
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