异体树突状细胞融合瘤苗抗骨肉瘤的免疫效应实验

【摘要】  探讨大鼠异体树突状细胞融合瘤苗诱导的抗骨肉瘤免疫学效应。 方法 采用Wistar大鼠骨髓来源的DCs与SD大鼠来源的骨肉瘤细胞UMR106通过电穿孔的方法进行融合。经分离纯化后，分别与SD、Wistar大鼠骨髓来源的T淋巴细胞作共同培养，刺激其增殖。采用流式细胞仪对其CD8+, CD4+细胞比例进行检测。MTT法测定细胞毒T淋巴杀瘤活性。结果 T淋巴细胞和异体融合瘤苗经过共同培养，T细胞得以显著增殖。异体瘤苗诱导的UMR106特异性CTLs杀瘤效果显著，该效应是由MHC?Ⅰ限制的CD8+细胞发挥作用。结论 异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗具有显著的刺激T淋巴细胞增殖和诱导特异性CTLs的潜能，为以树突状细胞为基础的免疫领域提供了新的策略，有望在临床骨肉瘤患者中获得广阔的应用前景。

【关键词】  树突状细胞 骨肉瘤 融合瘤苗 免疫治疗

   0  引  言

    瘤苗作为肿瘤特异性主动免疫治疗方式，目的是激发启动、调节增强机体固有的免疫功能和抗癌能力以维护机体生理平衡。它具有使机体由被动抗癌向主动抗癌转变的特点。目前瘤苗制备中抗原负载的方法种类繁多，其中通过细胞融合技术将肿瘤细胞与抗原呈递细胞（Antigen presenting cells, APCs）穿孔融合制成的融合瘤苗，被认为是最具可行性及临床应用价值的一类。在当前瘤苗的临床应用中，自体瘤苗的成功制备通常会受到疾病本身的困绕。而异体的树突状细胞可以从储备的健康志愿者外周血单核细胞获得，又可避免使所有肿瘤患者在接受免疫治疗前都必须提供相当量的自身外周血的缺陷，避免了“雪上加霜”[1?3]。本研究中，作者应用Wistar大鼠骨髓来源的DCs与SD大鼠来源的骨肉瘤细胞UMR?106通过电融合的方法进行细胞融合，制备异体融合瘤苗（DC/osteosarcom fusion cells, DOF），诱导T淋巴细胞增殖及骨肉瘤特异性CTLs。

    1  材料与方法

    1.1  材料  4～6周龄雄性SD、Wistar大鼠由第四军医大学实验动物中心提供（合格证号SCXK军?2002?005），并在无特定病原体（Specific pathogen?free conditions, SPF）条件下饲养；SD大鼠来源的骨肉瘤细胞系UMR?106购自美国ATCC（American Tissue Culture Collection）。

    1.2  主要仪器和试剂  MiniMACS磁性分离仪为德国Miltenyi Biotec GmbH公司产品；流式细胞仪为美国BD Phar Mingen公司产品；细胞融合仪为美国BTX公司的2001型产品；酶联免疫分析仪为芬兰Labsystem公司产品；rGM?CSF、rIL?4、rTNF?α购自R＆D公司；FITC标记抗大鼠MHCⅠ、MHCⅡ、FITC标记抗大鼠CD4、CD8、FITC标记抗大鼠CD44、PE标记抗大鼠OX62、PE标记抗大鼠CD80、CD86购自英国Serotec公司；小牛血清和RPMI?1640培养基为美国HyClone公司产品；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司。

    1.3  细胞培养与融合

    1.3.1  Wistar大鼠骨髓细胞的制备  取健康雄性4～6周龄Wistar大鼠，断颈处死，浸入750mol/L的乙醇中10min，无菌手术取出双侧股骨和胫骨，剥净肌肉组织，用PBS洗涤2遍，剪去骨两端，再洗涤2遍；用无菌注射器抽取5ml无血清RPMI?1640，将其针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓直至骨变白，收入50ml离心管中，1 500r/min离心收集骨髓细胞，弃上清，沉淀细胞用5ml 无血清RPMI?1640重悬，再经淋巴细胞分离液密度梯度离心，初步纯化单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells，BMMCs)，离心洗涤2次，收集沉淀的骨髓细胞。

    1.3.2  DCs的培养扩增及鉴定方法  见[4]。

    1.3.3  骨肉瘤细胞的培养和融合  SD大鼠骨肉瘤细胞系UMR?106培养在含100mol/L的小牛血清的RPMI?1640培养液中，呈单层生长。分别收集培养的DCs和骨肉瘤细胞，用细胞融合仪融合，操作按说明书进行。

    1.3.4  DOF的筛选  经过融合的细胞在培养瓶中生长24h后，弃去悬浮的细胞，收集贴壁生长的细胞。应用标记抗大鼠OX62单抗免疫磁珠MiniMACS分离柱筛选，标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时，去除膜表面不表达OX62的细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集OX62＋细胞，去除其中未融合的肿瘤细胞，具体操作按说明书进行。 

    1.3.5  DOF的表型检测  DOF培养扩增后，采用双色荧光标记流式细胞术测定DOF表面anti?rat CD44（FITC）和anti?rat OX62（PE）的表达水平。1×106个DOF悬液用PBS洗涤2遍，采用FITC标记抗大鼠CD44染色30min，再用PBS洗涤1次，然后用PE标记抗大鼠OX62染色30min。用PBS洗涤1遍后，制成1×109个/ml浓度的细胞悬液，采用流式细胞仪进行检测。

    1.4   DOF诱导的T淋巴细胞增殖效应及其亚群分析 

    1.4.1  T淋巴细胞的制备  按照培养DCs的方法制备SD或Wistar大鼠的BMMCs，采用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞。将尼龙毛柱高压灭菌，以温PBS洗柱，将柱内气泡排出，置37℃、5%CO2孵箱1h。然后将BMMCs细胞悬液加至柱的上端，待柱内PBS被完全排出时，关闭下端口，再放入孵箱中60min。用温PBS洗柱，收集洗脱液，得到富含T细胞的细胞悬液。用完全RPMI?1640液、含rhIL?2（100u/ml）的完全RPMI?1640培养基将T细胞调整为2×106/ml， 于37℃、5%CO2、100%湿度条件孵箱培养3天，期间半量换液1次，培养液成分同前。

    1.4.2  以DOF作为刺激细胞（分别将未经融合处理的DCs和UMR106作为对照），经60Co（30Gy）照射灭活，分别以空白/孔、1×103/孔、5×103/孔、2×104/孔接种于96孔培养板，每组设3个复孔，每孔再加入1×105个SD或Wistar大鼠的T细胞，终体积为200μl。在37℃、5% CO2、100%湿度条件下进行T淋巴细胞增殖；68h后，每孔加入新制MTT溶液，使其终浓度为2g/L，继续孵育4h，终止培养；离心（1 000r/min，5min）后弃去上清，加入DMSO 150μl/孔，震荡10min；酶联免疫分析仪于波长490nm处检测OD值，结果以3孔均值表示。刺激指数（Stimulating index, SI）=加刺激细胞孔OD值/不加刺激细胞孔OD值。

    1.4.3  T细胞亚群分析  采用流式细胞术分别对SD和Wistar大鼠来源的T细胞，在DOF刺激增殖前后CD8+和CD4+细胞比例进行检测。

    1.5  DOF诱导的特异性抗骨肉瘤CTLs效应 

    1.5.1  瘤苗特异性CTLs的体外培养  调整T细胞密度为1×106/ml，接种于24孔细胞培养板，每孔1ml。DOF经30Gy的60Co射线照射后作为刺激细胞，调整DOF和未经融合处理的DCs密度为5×104/ml，分别加入上述24孔板，每孔1ml，置37℃、5%  CO2、100%湿度条件下孵育7天，隔日半量换液；以DOF刺激的SD和Wistar大鼠的T细胞（DOF?T）作为效应细胞，未经融合处理的DC刺激的T细胞（DC?T）和单纯T细胞（T）为对照组。

    1.5.2  CTLs杀伤活性的MTT法检测  收集效应细胞（DOF?T、DC?T和T），调整细胞密度为2×106/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl（2×105/孔）；按不同效靶比例（E∶T分别为5∶1、10∶1、20∶1、40∶1），加入靶细胞UMR106；另设单独效应细胞组、单独靶细胞组和培养液空白对照组；每组设3个复孔，置37℃、5%  CO2、100%湿度条件下培养48h后，每孔加入新制MTT溶液，使其终浓度为2g/L，继续孵育4h，终止培养；离心（1 000r/min，5min）后弃，去上清，加入DMSO 150μl/孔，震荡10min；酶联免疫分析仪于波长490nm处检测OD值，结果以3孔均值表示。杀伤率如下：

    杀伤率（%）=（1-试验组OD值-效应细胞组OD值靶细胞组OD值-空白对照组OD值）×100%

    1.6  统计学处理  全部数据用计算机SPSS 11.0统计软件处理，T细胞增殖效应、T细胞亚群分析和CTLs杀伤活性比较均采用成组t检验，P<0.05为差异有显著性，各组数据均经过方差齐性检验。 

    2  结果

    2.1  DCs的体外培养扩增及鉴定  倒置显微镜下可见，前3天大部分细胞呈贴壁生长，体积小、形圆，细胞边界光滑；4～8天悬浮细胞数量增多，体积增大，细胞边界渐趋粗糙；9～12天大部分细胞呈悬浮生长，细胞数量进一步增多，体积进一步增大，边界可见明显的毛刺样突起。透射电镜下可见细胞表面存在大量褶皱和典型的不规则突起，呈典型的DCs状态。体外诱导后的DCs各种表型分子的表达水平：OX62为62.19％，MHC ClassⅠ为70.40％，MHC ClassⅡ为78.28％，CD80为55.58％， CD86为68.38％。

    2.2  异体融合细胞DOF的表型检测  Wistar大鼠DCs与UMR106骨肉瘤细胞以5∶1的比例混合后，加入细胞融合仪的电击槽，细胞在融合电压作用下发生了细胞膜之间的融合。MiniMACS分离柱筛选后的DOF，经双色荧光标记流式细胞术检测，CD44（FITC）和OX62（PE）双阳性细胞比例为49.43％，见图1。

    UMR106（左），DCs （中），和DOF （右）表面anti?rat CD44（FITC）和anti?rat OX62（PE）检测结果

    图1  双色荧光标记流式细胞术对

    UMR106，DCs和DOF进行表型检测

    2.3  DOF刺激T淋巴细胞增殖效应  以未加刺激细胞组作为空白对照。结果显示，DOF具有较强的刺激T淋巴细胞增殖的功能。在SD大鼠骨髓来源的T细胞组，DOF在各浓度的刺激指数（SI=加刺激细胞孔OD值/不加刺激细胞孔OD值）均高于未融合的DCs和UMR106，具有显著性差异（P<0.05），SI随刺激细胞与反应细胞比例增加而升高，见图2。而在Wistar大鼠的T细胞组，每组DOF和UMR106的SI之间没有统计学差异 （P>0.05），各浓度DOF和UMR106的SI均显著高于DCs的SI（P<0.05）,见图3。

    UMR106：大鼠骨肉瘤细胞系；DCs：未加抗原致敏的树突状细胞；DOF：骨肉瘤细胞UMR106与 DCs经电融合获得的异体融合细胞

    图2  DOF刺激SD大鼠T淋巴细胞增殖能力      

    UMR106：大鼠骨肉瘤细胞系；DCs：未加抗原致敏的树突状细胞；DOF：骨肉瘤细胞UMR106与 DCs经电融合获得的异体融合细胞

    图3  DOF刺激Wistar大鼠T淋巴细胞增殖能力    

    2.4  T细胞亚群分析  见图4。

    2.5  DOF诱导的特异性抗骨肉瘤CTLs效应  MTT法检测不同效靶比效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，结果显示：在SD大鼠骨髓来源的T细胞

    SD大鼠的T细胞组，CD8+细胞比例由诱导前的34.16%升高到74.85%；CD4+细胞比例由诱导前的59.19%降低到19.05%（左）；Wistar大鼠的T细胞组，CD8+细胞比例由诱导前的32.35%降低到25.09%；CD4+细胞比例由诱导前的63.35%升高到71.75%（右）。

    组，不同效靶比条件下，DOF?T组均显示对UMR106高效特异的杀伤活性，其杀伤能力与效应细胞数量成正比，显著高于DC?T组和单纯T细胞组（P<0.05）；DC?T组在不同效靶比时对UMR106的杀伤率与单纯T细胞组无显著差异（P>0.05），见图5。而在Wistar大鼠的T细胞组，DOF?T对UMR106的杀伤活性同样高于DC?T组和单纯T细胞组（P<0.05），见图6。

    3  讨论

    目前异体瘤苗的制备存在以下两种主要策略：第一、肿瘤细胞取自患者自体，DCs来源于健康志愿者；第二、采用患者外周血来源的树突状细胞与已经建系的肿瘤细胞（异体）相融合。这两种策略的优点都是显而易见的，却也都存在自身缺陷。本研究制备的异体融合瘤苗DOF，其肿瘤细胞UMR106来自SD大鼠，而其抗原呈递细胞源于Wistar大鼠的骨髓组织，那么针对后面制备的两种来源的T淋巴细胞而言，SD大鼠的T细胞与肿瘤细胞具有相同的遗传背景，而Wistar大鼠的T细胞将视DCs为“自身”成分。为了保证DOF的融合效率，作者对先前的实验技术[4]进行了改进，采用双色荧光标记流式细胞术测定DOF表面anti?rat CD44（FITC）和anti?rat OX62（PE）的表达水平。尽管anti?rat CD44并非大鼠骨肉瘤细胞特异性单抗，但其在骨肉瘤细胞和树突状细胞表面的显著表达差异[5，6]，足以在本研究中发挥有效的鉴别和标志作用。

    研究结果显示，DOF在刺激两类T淋巴细胞增殖效应过程中均发挥了显著作用，但亦不难看出，在以Wistar大鼠T细胞为反应细胞的实验组，UMR106和DOF的SI之间没有统计学差异。通过对T细胞亚群变化进行分析发现，在该增殖过程中，本该发挥主要抗肿瘤免疫效应的细胞毒性T细胞，即CD8+细胞，并未占据预期的增殖比重；而在排斥反应中处于中心地位的CD4+的效应T细胞发生了相当大幅度的增殖，而且该增殖效应必定是在克服了肿瘤抗原和同种异体抗原对CD8+细胞的刺激作用下产生的。因此，尽管CTLs效应的研究结果显示在以Wistar大鼠T细胞为效应细胞的实验组，DOF?T对UMR106的杀伤活性仍然高于对照组，作者还是有理由推测，该组DOF诱导的CTLs效应在很大程度上缺乏抗骨肉瘤的“特异性”，取而代之的是针对同种异体抗原的排斥反应，该反应在机体内部将获得更多效应细胞的参与，如B细胞、NK细胞和巨噬细胞等，排斥效应显然无法与针对性地杀骨肉瘤作用紧密关联。

    在机体免疫系统功能健全的情况下，肿瘤细胞仍然能够躲避被识别和杀灭，其中最主要的机制包括以下两个方面：一、主要组织相容性抗原复合体（MHC）分子异常；二、第二信号系统障碍。瘤苗的制备就是试图通过对肿瘤细胞的人为改造，来纠正机体在自体肿瘤细胞面前的此种无奈。由于MHC限制性机制的存在，CD8+T细胞只能识别靶细胞表面与自身相同的MHCⅠ类分子和抗原肽段形成的复合物，而CD4+T细胞只能识别靶细胞表面与自身相同的MHCⅡ类分子和抗原肽段形成的复合物，尽管有研究强调两类MHC分子之间的交叉呈递作用[7]和肿瘤细胞之间所谓“共同抗原”（common antigens）的存在[8]，本研究仍然不主张在不同个体之间对提供靶抗原的肿瘤细胞作交叉使用；而以B7、ICAM为代表的共刺激分子和其他一些在活化T细胞中发挥作用的表型抗原，是人类免疫系统活化过程中一类通用的信号分子，即使其来源于异体组织，仍然不会泯灭其功效。

    那么在选择异体瘤苗制备方案时，本研究结果支持最佳候选细胞为患者自身肿瘤细胞，而抗原呈递细胞（例如树突状细胞）可以来源于健康志愿者。尽管该方案仍将不可避免地面临前面所提到的以原代肿瘤细胞培养为例的诸多困难，但从免疫功效本身来衡量，该方案显然具有更好的应用前景和开拓价值。

【】
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/[4/] 于哲，范清宇，马保安，等. 大鼠树突状细胞融合瘤苗的特异性抗骨肉瘤作用/[J/].癌症,2005，24（3）:285?291.

/[5/] Santini MT, Rainaldi G, Ferrante A, et al. Effects of a 50 Hz sinusoidal magnetic field on cell adhesion molecule expression in two human osteosarcoma cell lines (MG?63 and Saos?2)/[J/]. Bioelectromagnetics, 2003,24(5):327?338.

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/[7/] Koido S, Hara E, Homma S, et al. Dendritic cells fused with allogeneic colorectal cancer cell line present multiple colorectal cancer?specific antigens and induce antitumor immunity against autologous tumor cells/[J/]. Clin Cancer Res, 2005,11(21):7891?7900.

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