大葱油对体内外人胃癌细胞生长的抑制作用

                作者：周晓娜,任锡玲 ,常丽丽 ,张静　    

【摘要】  　　目的 观察大葱葱白提取物大葱油对人胃癌MGC803细胞的体内外生长抑制作用。方法 用MTT，裸鼠移植肿瘤重量测定,DNA指数和平均DNA质量及TUNEL法，观察大葱油对离体培养的MGC803胃癌细胞系和裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果 大葱油24h、48h、72h的IC50 分别为52μg/ml,38μg/ml,20μg/ml。肿瘤生长抑制率为36.07%。实验组肿瘤DNA指数和平均DNA质量下降。TUNEL测定显示，实验组细胞凋亡率为（15.23±1.82）%，对照组为（2.77±0.62）%，差异有显著性。结论 大葱油对体内外人胃癌细胞的生长具有抑制作用，其机制可能与其抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡有关。

【关键词】  大葱油　人胃癌细胞　生长

　In Vivo and in Vitro Effects of Allium Fistulosum L Oil on Growth of Human Gastric Carcinoma Cells

      Key words：AFLO;Human gastric carcinoma cells;Growth

　多组流行病学资料显示经常食用大蒜、大葱等葱属类植物可明显降低胃癌的发病率[1,2]。 本试验采用大葱葱白提取物大葱油作用于人胃癌细胞MGC?803及荷瘤的裸鼠，观察其作用。 

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1细胞人胃低分化粘液腺癌细胞株MGC?803细胞，购自河北医科大学细胞生物室。

    1.1.2动物  6～7周龄昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重20～22克，购自河北医科大学实验动物中心。6～8周龄SPF级的BALB/c裸鼠，雄性，体重18～22克，购自协和医科大学实验动物中心。

    1.2方法

    1.2.1大葱油的制备  用本地产无农药污染的新鲜大葱去皮去叶。取葱白部分，用常压蒸馏法和水醇法提取挥发油。将吐温?80 0.8g加入无菌去离子水至40ml,制成20mg/ml的吐温?80溶液后，再加入大葱油0.4g,安瓿封存， 100℃流通蒸气灭菌30min，贮存在避光处。

    1.2.2大葱油的急性毒性实验[3]  昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重20～22克，10只为一组，共分二组，第一组腹腔注射大葱油0.5ml，第二组腹腔注射大葱油0.25ml，用药后观察一周未见小鼠死亡，遂行最大耐受量试验。仍取昆明种小鼠20只，雌雄各半，体重20～22g。禁食15h，不禁水，实验日给小鼠腹腔注射最大浓度（10mg/ml）和最大容积（1ml）大葱油，上、下午各一次。给药后常规饲养，观察7天，期间小鼠自由进食，7天后脱颈处死小鼠，解剖后观察心、肺、胃、肠、肝、脾等主要脏器有无异常。

    1.2.3细胞培养  将 MGC?803细胞用RMPI1640培养基培养，内含15%新生小牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素，置入37℃，5% CO2条件下的培养箱中，每日观察细胞生长情况。

    1.2.4大葱油对胃癌细胞增殖的影响（MTT法）[4]  取对数生长期的MGC?803细胞，以 1×105 /ml的浓度接种于96孔培养板，培养 24h后分组，实验组大葱油的终浓度分别是100μg/ml、75μ g/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml，同时设立相应浓度的溶剂（吐温?80）为对照组。每组设3个复孔，加药后分别继续培养24h、48h、72h后，各加入噻唑蓝，37℃作用4h，每孔加入400μl二甲基亚枫。用震荡器震荡10min，在全自动酶标仪上以波长490nm测定光密度值。按公式：肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1?实验组光密度值/对照组光密度值）×100%。求出大葱油第24h、第48h、第72h的半数杀伤浓度（IC50）。          

    1.2.5人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立  选用对数生长期MGC?803细胞用于实验，收集并调整细胞数为1×107/ml，在无菌条件下，裸鼠左腋皮下接种0.2ml，注射局部出现明显皮丘后,观察至出现结节，移植瘤模型建立。

    1.2.6动物分组及大葱油的用法  10只裸鼠的移植瘤生长至可触及时，分两组。两组间裸鼠体重分别为（18.59±1.37）g、（18.43±1.34）g，无显著性差异（P＞0.05）。

    实验组（5只）腹腔注射10mg/ml大葱油0.5ml/次,对照组（5只）腹腔注射20mg/ml吐温?80 0.5ml/次,每天固定时间注射两次，连续32天。

    1.3移植瘤检测

    1.3.1抑瘤效果的观察  ① 实验期动态观察肿瘤生长情况，每周用游标卡尺测量肿瘤最大长径（a）及最小短径（b），根据公式V=ab2/2，肿瘤体积（mm3）[5]。末次给药24h，实验结束，脱颈处死裸鼠，剥离肿瘤，测量瘤重，根据公式计算肿瘤生长抑制率。公式：肿瘤生长抑制率（%）=对照组平均瘤重?实验组平均瘤重/对照组平均瘤重×100%。② 剥离的肿瘤用10%中性甲醛溶液固定，用于HE及Feulgen染色。

    1.3.2DNA图象分析DNA指数及平均DNA质量  将Feulgen染色的切片在高倍镜下（10×40）观察，选择无重叠者为测试对象。每张切片随机取100个肿瘤细胞作为阳性细胞，以同一张切片中的40个淋巴细胞作为对照细胞，由图象分析仪分析其DNA指数及平均DNA质量。

    1.3.3TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡  切片脱蜡、水化，胃蛋白酶消化，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，加新配制的TdT酶，37℃孵育1h，终止液终止TdT酶反应，加抗地高辛过氧化物酶复合物室温孵育30min，二氨基联苯胺显色，甲基绿衬染，中性树胶封片，镜下观察。阳性对照：在TdT酶处理前用DNA酶预处理；阴性对照：不经TdT酶处理。结果判定：凋亡细胞的细胞核呈棕黄色，选择凋亡密集的部位，由2名病理医生采用双盲法计数5～10个高倍镜视野，以凋亡细胞占总细胞数的百分比作为凋亡指数。

    1.4统计学处理所得数据为计量资料，用均数±标准差（±s）表示，用SPSS10.0统计软件进行t检验。IC50测定应用POMS统计软件。

    2结果

    2.1大葱油对胃癌细胞增殖的影响   当大葱油的浓度分别为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml时，增殖抑制率具有浓度依赖性和时间依赖性,见表1。第24h、第48h、第72h的 IC50分别为52μg/ml、38μg/ml、20μg/ml，见表1。 表1  大葱油对胃癌细胞的增殖抑制作用

    2.2大葱油的最大耐受量试验观察7天，小鼠无一只死亡，进食、活动、体重均未见异常，解剖后大体观察，与正常小鼠脏器的大体观察结果一致。

    2.3大葱油的肿瘤生长抑制率自大葱油注射之日起，每7天的肿瘤平均体积，对照组第7天、14天、21天、28天、32天分别为：111.25 mm3、297.43 mm3、644.21 mm3、1130.69 mm3、1197.78 mm3；实验组分别为：99.87 mm3、243.25 mm3、382.54 mm3、688.93 mm3、762.61 mm3，见图1。对照组总平均瘤重为（1.22±0.15）g；实验组总平均瘤重为（0.78±0.09）g。肿瘤生长抑制率为36.07%。

    2.4移植瘤的病理观察

    移植瘤位于裸鼠皮下，呈圆形或椭圆形，质地中等，灰白色，早期活动度大，晚期较固定，有的与皮肤粘连；切面为实体性，灰白色。显微镜下观察，肿瘤 

    图1  移植瘤生长曲线

    细胞多呈弥散排列，瘤细胞呈多角形、圆形等多种形态。对照组瘤细胞核大，核膜厚，核分裂象多，可见病理性核分裂，细胞生长旺盛；实验组细胞核小，细胞碎裂较多，核分裂象少。

    2.5DNA指数及平均DNA质量

    胃癌移植瘤行DNA图象分析，实验组DNA指数及平均DNA质量较对照组明显降低（P＜0.05），见表2。表2大葱油对移植瘤DNA指数和平均DNA质量的作用(

    2.6TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率实验组肿瘤细胞凋亡率为 (15.23±1.82)%与对照组比较,差异有显著性（P＜0.05）。

    3讨论

    大葱是草本百合科植物，其鳞茎葱白部分含辛辣味挥发油，其主要成分为蒜辣素、烯丙基二硫化物、二烯丙基二硫化物(DAS)、环蒜氨酸、蒜氨酸、丙烯基巯基半胱氨酸等[6]。其中DAS及其衍生物S?丙烯基?半胱氨酸可抑制致癌物的代谢酶活性，使致癌物的前体不能代谢活化，从而抑制其致癌过程[7]。大葱在体外对Hela细胞株有抗增殖作用[8]，而且其所含的主要成分蒜辣素和大蒜油的成分相似，李晓光等［9］报道大蒜油可通过抑癌基因p53和p21的表达抑制细胞恶性增殖，诱导凋亡，促进分化。

    本实验我们采用MTT法证实大葱油在体外具有抑制肿瘤细胞生长的作用，在体内作用于荷瘤裸鼠，称瘤重肿瘤生长抑制率，说明大葱油有一定的抗肿瘤作用。肿瘤组织形态学显示对照组肿瘤细胞增殖旺盛，核分裂象数目多；实验组核分裂象数目少。                                   

    诱导细胞凋亡是肿瘤的重要机制。肿瘤细胞凋亡的早期特征之一为 DNA 断裂，暴露 3’羧基末端， TUNEL法即是通过对细胞DNA的缺口进行标记，使凋亡的细胞着色，通过光镜可直观且清晰地观察凋亡细胞并进行定量测定。DNA指数及平均DNA质量是反映肿瘤细胞增殖能力强弱的常用指标，可反映肿瘤细胞的增殖状况。本实验证实移植瘤细胞凋亡指数明显增高。移植瘤细胞DNA指数下降，平均DNA质量减少。由此推测，大葱油对胃癌细胞的生长具有抑制作用，其机制可能与其抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡有关,在启动细胞凋亡机制的同时使细胞增殖减缓,细胞生长受到抑制的同时又加速死亡,从而抑制肿瘤生长。

    目前，用于治疗肿瘤的药物种类很多，但每一种药物在抗肿瘤的同时对正常组织亦有毒性作用，还可能引起不良反应。而葱属类植物迄今没有发现有明显的毒副作用，且来源广泛，是一种具有广阔开发前景的植物药，亟待进一步深入研究，以便及早推广应用。

【】
  　　［1］ Takezaki T,Gao CM,Ding TH,et al.Protective effect of allium vegetable against both esophageal and stomach cancer: a stimultaneous case?referent study of a high?epidemic area in Jiangsu Province,China[J].Jpn J Cancer Res,1999,90(6): 614?621.

[2]Munoz N,Plummer M,Vizas J,et al.A case?control study of gastric cancer in Venezuela[J].Int J Cancer,2001,93(3):417?423.

[3]孙敬方.动物实验方法学[M]．北京:人民卫生出版社，2001.359?361.

[4]Carmichrel J,Degraff WG,Gazdr AF,et al.Evaluation of a tetrazolium based seminantomated colorimetric assay: assessment of chemosentivity testing[J].Cancer Res,1987,47(4): 936?942.

[5]Sato Y,Kashimoto S,Macdonald JR,et al.In vivo anti?tumor efficacy of MGI?114 (6?hydroxymethylacylfulvene,HMAF) in various human tumor xenograft models including several lung and gastric tumours[J].Europen Journal of Cancer,2001,37(11): 1419?1428.

[6]医学院药物研究所等主编.中药志[M].第２册.人民卫生出版社.1961.622.

[7]邬忠梅，于德泉，业浦珠.葱属植物化学及药理研究进展[J]. 药学学报，1999，34（5）：395?400.

[8]韩正高，赵萍，王丽君.大葱在体外对Hela细胞株的抗增殖作用.天津胸科营养科[J].营养学报,1996,18(2):203?205.

[9]李晓光,谢锦玉,李文梅,等.大蒜油诱导人胃癌细胞分化和凋亡的机制研究[J].中华肿瘤杂志,1998,20(5):325?327.