放射与抗VEGF抗体对人肝癌移植瘤生长的抑制作用

                   作者：郑青平,陈龙华,石玉生

【摘要】  　　目的 观察放射与抗VEGF单抗对人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 SMMC?7721肝癌细胞种植于裸鼠后肢皮下,成瘤动物分为放射+抗体组、放射组、抗体组和对照组,单抗每次每只50μg隔日腹腔给药,共6次,放射剂量20Gy一次给予,测肿瘤直径并瘤体积。抗体给药结束后2周处死动物,称瘤重,免疫组化法测肿瘤微血管密度。结果 放射和抗VEGF单抗明显抑制肿瘤生长,减少肿瘤微血管密度,但两组之间差异无显著性。放射与抗VEGF单抗联合较单纯放射或抗体抑瘤作用显著,三组瘤重抑制率分别为89.2%、75.3%和65.9%,差异有显著性。结论 放射结合抗VEGF单抗显著抑制肝癌移植瘤生长,是肝癌综合的有效途径。

【关键词】  肝肿瘤　放射疗法　抗VEGF单抗;裸鼠

　　The Inhibiting Effect of Radiation and Anti?VEGF Monoclonal Antibody on the Growth of Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts

          Key words：Hepatocellular carcinoma;Radiotherapy;Anti?VEGF mAb;Nude mice

　　肝癌是放射不敏感肿瘤,而肝脏对放射线较敏感,常规放射治疗的疗效不满意[1]。肿瘤血管形成对肿瘤生长及转移起着关键性作用,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是肿瘤血管形成的关键因子,抗血管形成可抑制肿瘤生长。肝癌是富血管肿瘤,抗血管形成治疗能抑制肝癌裸鼠移植瘤生长[2]。本文结合放射与抗血管形成治疗,观察两者对肝癌移植瘤生长的协同抑制作用。

    1材料与方法

    1.1材料

    实验动物 BALB/c?nu/nu小鼠22只,购自南方医科大学实验动物中心,5～6周龄,雄性,体重19.0～22.0g,SPF层流柜分笼饲养。SMMC?7721人肝癌细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。抗VEGF单抗，克隆号26503.11购自Sigma公司。

    其他主要仪器和试剂：培养箱（37℃、5%CO2）,Varian 23EX医用直线加速器（美国）,RPMI?1640细胞培养液（含10%胎牛血清、青链双抗各100u/mg、100μg/ml）、胰酶,免疫组化SABC法相关试剂购自武汉博士德公司。

    1.2方法

    细胞繁殖传代,取指数生长期细胞胰酶消化，2 000r/s离心2min,收集细胞用0.9%生理盐水悬浮,显微镜下计数细胞浓度,生理盐水定容至2×107/ml。

    方法[3],裸鼠于饲养环境适应1d后种植,取裸鼠右后肢大腿外侧皮下为种植点,1ml注射器抽取0.2ml细胞悬液（含4×106个细胞）注入种植点皮下。

    肿瘤种植后1周,形成明显皮下肿块,种瘤后10d肿块直径约5mm。有1只动物未成瘤,1只动物成瘤直径2mm,此2只动物舍去。其余20只动物按随机原则分为,放射+抗体组、放射组、抗体组和对照组,每组动物5只。用游标卡尺测量肿块长径a及横径b,隔日测量1次,体积公式V=a×b2/2。

    无菌PBS液溶解抗体至100μg/ml,种瘤后10d分组后腹腔注射给药,抗体量50μg/只,隔日1次,共6次,无抗体组同样途径给予等体积量PBS。第4次注射抗体后24h放射治疗,放疗机房紫外线消毒,受照动物四肢以细绳固定在小木板上,照射野大小3×3cm,源皮距100cm,6MeV线,剂量率4Gy/min,总剂量20Gy一次性给予。

    种瘤后34d处死动物,分离肿块周边皮肤及非肿瘤组织,天平称重,瘤重抑制率=（1?实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。

    1.3免疫组化微血管密度(MVD)测定

    肿瘤组织10%甲醛固定24h,脱水石蜡包埋,切片厚5μm,免疫组化SABC法:一抗为多克隆兔抗鼠CD34,工作液1∶100稀释。即用型SABC免疫组化试剂盒,具体操作按试剂盒说明进行,DAB染色,苏木素复染,树胶封片。选细胞染色密集区高倍镜(×200)计数染色细胞,每片计数5个野取平均值。

    1.4统计学处理

    SPSS10.0统计分析软件,应用重复测量数据方差分析和多个独立样本非参数检验法处理数据,Ｐ＜0.05为统计学差异有显著性。

    2结果

    2.1放射及抗VEGF抗体抑制肿瘤生长

    移植瘤成瘤率高95.5%（21/22）,分组时各组瘤体积无显著性差异。放射前给予抗体4次,肿瘤生长减慢,但差异不显著。种瘤后20d放射+抗体组、放射组和抗体组肿瘤体积显著小于对照组,且放射+抗体组较单纯放射或单纯抗体组对肿瘤生长的抑制有显著差异,此显著性差异一直持续至动物处死,而单纯放射组与单纯抗体组之间差异不显著,见表1。表1放射和抗VEGF单抗对肿瘤生长的抑制作用与对照组比较:**P＜0.001,*P＜0.05;与放射+抗体组比较:#P＜0.052.2瘤重抑制率和MVD放射+抗体组对瘤重的抑制强于放射组或抗体组,且放射组平均瘤重低于抗体组。各处理组MVD低于对照组,放射+抗体组低于放射组或抗体组,放射组与抗体组之间差异无显著性,见表2。表2瘤重抑制率与微血管密度与对照组比较:*P＜0.001;与放射+抗体组比较:##P＜0.001，#P＜0.05;与抗体组比较:☆P＜0.05

　　3讨论

    肿瘤生长及转移与肿瘤血管形成密切相关,VEGF是肿瘤血管形成的主要活性因子。研究表明,抗VEGF抗体能抑制移植瘤生长,降低转移率[4,5]。肝癌肿瘤血管丰富,癌细胞表达VEGF,抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体均能抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长,降低微血管密度 [2，6]。抗VEGF单抗能抑制SMMC?7721人肝癌移植瘤生长和降低肿瘤微血管密度,说明人肝癌裸鼠移植瘤表达了VEGF,抗VEGF单抗通过阻滞肿瘤血管形成而抑制肿瘤生长。

    放射与抗血管形成剂联合治疗胶质瘤、胰腺癌的实验研究表明，两者联合取得了控制肿瘤的协同作用[5，7]。抗血管形成剂不但减少肿瘤血管数目,而且通过改造肿瘤血管功能,使肿瘤对放射线更敏感,发挥放射增敏效应,如Winkler等[8]发现,抗VEGF受体抗体能诱导肿瘤血管出现一个“血管正常化的窗口期”,窗口期内肿瘤血管与正常血管功能相似,肿瘤氧水平高,肿瘤细胞对放射线敏感,在窗口期内放射治疗才能起到协同抗肿瘤作用。“血管正常化窗口期”出现在抗体治疗1周左右,抗VEGF单抗是否也诱导了这样一个窗口期并不清楚,我们实验中在抗体治疗1周时给予放射,正是基于这样一个窗口期的启示。

    放射可诱导肿瘤细胞表达VEGF升高[9],促进血管形成;同时放射对肿瘤细胞有直接杀灭作用,并引起肿瘤血管内皮细胞凋亡增加,减少VEGF刺激的目的细胞,共同作用的结果导致血管密度降低。而抗VEGF抗体则是通过中和VEGF或抑制其表达来减少对血管内皮生长的刺激,从而降低血管密度。

    Kaliski等[10]发现,放射通过肿瘤内环境诱导了一种保护肿瘤的途径,使肿瘤抗拒放射。VEGF保护放射诱导的血管内皮细胞凋亡,而此作用可以被抗VEGF抗体阻滞,因而抗VEGF抗体强化了放射的细胞毒作用,提高肿瘤的放射敏感性[11],这是放射与抗VEGF抗体联合治疗肿瘤的理论依据。放射+抗VEGF单抗在抑制肝癌移植瘤生长和降低肿瘤血管密度上,较单纯放射或抗VEGF单抗效果显著,可作为一种新的肝癌综合治疗方法的理论之一。

【参考】
  　　［1］ 殷蔚伯,谷铣之.肿瘤放射治疗学[M].第3版.北京:协和医科大学出版社,2002.783?784.

[2]解乃昌,李国威,王志亮,等.抗血管内皮生长因子抗体对实验性肝癌的生长抑制作用[J].中国普外基础与临床杂志,2002,9(4):242?245.

[3]郑红,王琳,李静芳.裸鼠皮下人肝癌移植瘤模型的建立[J].昆明医学院学报,2003,24(3):39?41.

[4]潘立峰,王丽华,赵志荣.抗VEGF抗体及抗KDR抗体对人胃癌生长的抑制作用[J].中国肿瘤临床,2004,31(4):235?237.

[5]Bockhorn M,Tsuzuki Y,Xu L,et al.Differential vascular and transcriptional responses to anti?vascular endothelial growth factor antibody in orthotopic human pancreatic cancer xenografts[J].Clin cancer res,2003,9(11):4221?4226.

[6]Liu Y,Poon RT,Li Q,et al.Both antiangiogensis?and angiogensis?independent effects are responsible for hepatocellular carcinoma growth arrest by tyrosine kinase inhibitor PTK787/ZK222584[J].Cancer Res,2005,65(9):3691?3699.

[7]Damiano V,Melisi D,Bianco C,et al.Cooperative antitumor effect of multitargeted kinase inhibitor ZD6476 and ionizing radiation in glioblastoma[J].Clin Cancer Res,2005,11(15):5639?5644.

[8]Winkler F,Kozin SV,Tong RT,et al.Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation:role of oxygenation,angiopoietin?1,and matrix metalloproteinases[J].Cancer Cell,2004,6(12):553?563.

[9]Steiner HH,Karcher S,Mueller MM,et al.Autocrine pathways of the vascular endothelial growth factor(VEGF) in glioblastoma multiforme:clinical relevance of radiation?induced increase of VEGF levels[J].J Neurooncol,2003,66(1?2):129?138.

[10]Kaliski A,Lassau N,Maggiorella L,et al.Antiangiogenic effect and tumor growth control achieved by an MMP inhibitor combined to radiation in vivo,targeting radio?induced MMP?2 enhancement and VEGF modulation[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2004,60(Sup1):368?369.

[11]Lee CG,Heijn M,Tomaso ED,et al.Anti?vascular endothelial growth factor treatment augments tumor radiation response under normoxic or hypoxic conditions[J].Cancer Res,2000,60(10):5565?5570.