肝癌微环境中CD4+CD25+Treg细胞与肿瘤免疫细胞的关系
作者：陈中 晏建军，倪家连，刘鲁岳，黄亮，严以群
【摘要】 ［目的］ 探讨肝癌微环境中Treg细胞的数量增多与HCC临床分期晚的可能原因。［方法］ 双重酶标免疫组织化学方法检测52例HCC组织中CD4+CD25+Treg细胞以及CD4+CD25-T（CD4+T）细胞分布，免疫组化EnVision法检测20例HCC组织中CD8+T细胞分布。［结果］ 正常肝脏组织中未发现Treg细胞，HCC组织中Treg细胞数量较癌旁组织明显增多（P=0.000），且肝癌组织中Treg细胞的数量与其浸润性CD4+T淋巴细胞的数量以及CD4+T/CD8+T比值呈显著负相关（r＝-0.539，P＝0.014；r＝-0.545，P＝0.000），而与浸润性CD8+T淋巴细胞的数量无明显相关性（r=-0.403，P=0.078）。［结论］ Treg细胞在体内可能通过细胞接触的方式抑制CD4+T 淋巴细胞的增殖来抑制肿瘤局部的免疫，去除或减少HCC微环境中浸润性Treg细胞数量可能提高肿瘤局部免疫效果。
【关键词】 CD4+CD25+调节性T细胞 癌 肝细胞性 肿瘤浸润 淋巴细胞
Correlation between the Distribution of CD4+CD25+ Regulartory T(Treg) Cells and T-cell Infiltration in Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma
Abstract: ［Purpose］ To explore the causes of an increased prevalence of regulartory T(Treg) cells in microenvironment of hepatocellular carcinoma(HCC) which involved in TNM stage according to disease progression. ［Methods］ The CD4+CD25+ Treg and CD4+CD25-T (CD4+T) cells in the slides tissues of 52 cases with HCC were marked by Double-immunohistochemical, and CD8+T cells in the slides tissues of 20 cases with HCC by EnVision. ［Results］ There was no Treg cell in normal liver tissues. The number of Treg cells in the tissue of HCC was significantly more than that in the tissue of peri-cancer(P=0.000). The number of Treg cells in HCC tissue was negatively correlated to the ratio of CD4+T/CD8+T and CD4+T cells infiltration (r＝-0.539，P＝0.014；r＝-0.545，P＝0.000), however, with no correlation to CD8+T cells infiltration(r=-0.403,P=0.078). ［Conclusions］ Treg cells possibly suppress proliferation of CD4+T cells in a contact-dependent manner so that tumor cells can escape immune surveillance and result in invasion and progression. Functional deletion of tumor-infiltrating Treg cells in microenvironment of HCC can enhance tumor-specific immunotherapy.
Key words: CD4+CD25+ regulartory T cell; hepatocellular carcinoma； tumor infiltrating；lymphocytes
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是指位于原发和继发肿瘤细胞周围的淋巴细胞，主要由T 细胞组成。TIL具有杀伤肿瘤细胞、降低转移潜能的作用，因其与肿瘤细胞密切接触而被认为是机体对肿瘤识别的直接而特异的表现，肿瘤组织中浸润免疫细胞数量和功能的变化在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的强度和总体水平。本研究用双重酶标免疫组织化学的方法检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC）微环境中CD4+CD25+（regulatory T，Treg）细胞、CD4+CD25-T（CD4+T）细胞的数量分布以及两者真实浸润状态，用免疫组化方法检测HCC组织中浸润免疫活性细胞分布，探讨HCC微环境中Treg细胞的分布与肿瘤微环境浸润免疫活性细胞的关系，研究肿瘤发生的可能机制，为肿瘤的局部免疫治疗提供新的治疗思路。
1 材料与方法
1.1 研究对象
东方肝胆外科2004年12月至2005年5月手术患者经病检查证实HCC标本52例（均包括肝癌组织以及癌旁组织），取材时癌旁组织为距癌结节2cm以内的肝组织；避开坏死区，术前均未接受包括经肝动脉栓塞化疗在内的任何其它治疗。男性42例，女性10例，年龄29岁~71岁(平均49.2岁）。正常肝组织8例，取自肝血管瘤、肝囊肿的周围正常肝组织，男性3例，女性5例，年龄27岁~57岁(平均42.4岁)。所有研究对象均无糖尿病、类风湿、甲状腺功能亢进等自身免疫性疾病史以及免疫治疗史。
1.2 主要试剂
小鼠抗人CD4单克隆抗体（DAKO公司生产），使用时用抗体稀释液稀释为1∶100；小鼠抗人CD25单克隆抗体（DAKO公司生产），使用时用抗体稀释液稀释为1∶200；即用型羊抗小鼠辣根过氧化物酶（HRP）标记的EnVision二抗（DAKO公司生产）；生物素化羊抗兔IgG和链酶亲合素标记的碱性磷酸酶，使用时均稀释液稀释为1∶200（ Zymed公司生产）；小鼠抗人CD8单克隆抗体（DAKO公司生产），使用时用抗体稀释液稀释为1∶100。
1.3 实验方法
采用双重酶标免疫组织化学。苏木素衬染色，热水蓝化；吹干后，树脂封片；将切片置于显微镜下采用盲法进行观察，先在低倍镜下观察整张切片，随机选择5个高倍视野(×400)计数阳性细胞，并求平均值。
1.4 统计学处理
对各种组织中的Treg细胞的分组计数结果以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 11.0统计软件采用非参数检验方法Mann-Whitney T法对数据进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
8例良性肝病周围正常肝组织中未发现Treg细胞，52例HCC组织以及癌旁组织Treg细胞单个高倍视野平均数分别为7.6308±2.8368、5.1654±1.6718；两组比较存在显著性差异（P＝0.000）；而且在HCC组织中Treg细胞数量随着临床病理分期的进展而增多，18例Ⅰ期、22例Ⅱ期、12例Ⅲ期各组Treg细胞单个高倍视野平均数分别为6.7333±1.5980、7.8818±2.4171、8.5167±2.2480，统计学上有显著性差异（P=0.000）；癌旁组织中Treg细胞多数以散在方式分布，而在癌组织中以簇丛状方式聚集分布于肿瘤间质内与CD4+T细胞伴行，并与之紧密接触。20例HCC组织、癌旁组织中CD4+T/CD8+T比值分别为0.3687±0.0805、0.5301±0.0919，肝癌组织较癌旁组织明显降低，差异有统计学意义（P＝0.022）；20例肝癌组织中Treg细胞的数量与其浸润性CD4+T淋巴细胞的数量，以及CD4+T/CD8+T比值呈显著性负相关（r＝-0.539，P＝0.014；r＝-0.545，P＝0.000）见图1、2，而与浸润性CD8+T淋巴细胞的数量分布无明显相关性（r=-0.403，P=0.078）。
3 讨 论
在控制具有免疫原性的肿瘤细胞生长过程中，T细胞介导的免疫应答起着重要的作用。对于许多恶性肿瘤尤其是早期病例，在局部出现免疫抑制的状态下而全身免疫并无缺陷，因此通过检测患者外周血的免疫细胞分布来判断宿主的免疫反应并不完全。在局部抗肿瘤免疫中，TIL起着重要的作用。它在患者体内处于机体免疫系统与肿瘤相互作用的最前沿，其组成和功能等在一定程度上反映了机体抗肿瘤反应的性质、强度和总体水平。T 淋巴细胞亚群之间的细胞平衡是维持免疫系统内部环境稳定的中心环节。CD4+T/ CD8+T比值保持动态平衡，以维持机体细胞免疫功能的稳定，当其比值降低，则患者细胞免疫功能低下，从而有利于肿瘤增殖[1]。本实验结果发现，癌旁组织中CD4+T细胞数量较癌组织明显增多，差异有显著性意义，而癌旁组织CD8+T细胞数量较癌组织少，差异无统计学意义，且癌旁组织CD4+T/CD8+T比值较癌组织升高，差异有显著性意义（P<0.05）。该结果提示HCC组织局部CD4+T细胞数量和CD4+T/CD8+T比值的降低，造成了 T 淋巴细胞数量异常，改变了组织局部免疫微环境，免疫抑制逐渐加重，免疫监视功能减弱，有利于肿瘤细胞增殖，从而有利于肿瘤的进展、侵袭或转移。
体外肿瘤浸润淋巴细胞具有一定的抗瘤活性，过继免疫是将免疫细胞经体外分选激活，然后回输体内的治疗方法，尽管用各种方式激活TIL进行过继免疫治疗，但至今未表现出理想效果。研究显示恶性肿瘤患者的免疫系统在肿瘤局部和全身都处于耐受或缺陷状态。研究表明在诱发阶段调节性T细胞诱导TIL发生免疫偏倚，有的则因Treg数量显著增多使TIL几无功能，使TIL的抗瘤免疫陷入困境[2]。在以细胞免疫为主的肿瘤免疫过程中，Treg处于关键环节，它在肿瘤组织中的浸润程度代表了机体肿瘤免疫抑制反应的一个方面，在机体免疫调节中起重要作用，决定免疫反应的最终走向是激活免疫还是诱导耐受。本实验研究了肝癌组织中Treg细胞数量与CD4+T以及CD8+T、CD4+T/ CD8+T比值之间的关系，发现肝癌组织中Treg细胞数量与CD4+T细胞数量以及CD4+T/CD8+T比值呈显著性负相关，而与CD8+T细胞数量无明显相关性，提示HCC组织中Treg细胞可能通过抑制CD4+T细胞的增殖，导致T 淋巴细胞亚群之间的平衡被破坏。众所周知，CD4+T/CD8+T比值在机体免疫反应及免疫调节中具有重要作用，其变化反映出机体免疫状态的变化，肿瘤组织和癌旁组织的TIL中该比值的下降表明愈接近肿瘤部位细胞免疫受抑制愈明显。因此我们认为HCC局部TIL的这种分布特征改变了组织局部免疫微环境，免疫抑制逐渐加重，免疫监视功能减弱，有利于肿瘤细胞增殖。
目前对Treg细胞的效应机制还不明确，实验结果也存在矛盾。有些实验支持Treg细胞是通过与细胞接触发挥抑制作用；另一些研究表明Treg通过分泌细胞因子（IL-10、TGF-β）而介导抑制效应。我们研究发现HCC微环境中Treg的分布具有异质性，癌旁组织中Treg大部分以散在方式分布，而在肿瘤组织中大多Treg呈簇丛状分布，与效应性T淋巴细胞相伴，这些分布在肿瘤组织中的Treg由于与效应性T淋巴细胞的紧密接触，抑制效应性细胞的功能，从而发挥抗肿瘤免疫作用。提示Treg可能是通过细胞与细胞之间的紧密接触发挥其抑制作用。
近年来，肿瘤的免疫治疗包括肿瘤疫苗以及TIL细胞过继免疫治疗已经过大量的试验，但其抗肿瘤作用是有限的[3，4]。Treg细胞尤其是肿瘤微环境中数目增多是肿瘤免疫治疗亟待解决的问题之一。研究表明，通过去除机体Treg细胞可以提高肿瘤疫苗的抗瘤效应[5]，进一步了解Treg细胞调节机制或控制Treg细胞增殖的方法可以设计更有效的抗肿瘤免疫疗法。
【】
[1] Ohwada S, Iino Y, Nakamura S, et al. Peripheral blood T cell subset as a prognostic factor in gastric cancer[J]. Jpn J Clin Oncol,1994, 24(1):7-11.
[2] 傅志旋,陈晓耕, 刘振华. 肿瘤浸润淋巴细胞的抗肿瘤免疫困境[J]. 国外医学·肿瘤学分册, 2004,31（3）:183-186.
[3] Kono K, Takahashi A, Ichihara F, et al. Prognostic significance of adoptive immunotherapy with tumor-associated lymphocytes in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial[J].Clin Cancer Res,2002,8(6):1767-1771.
[4] Kono K,Takahashi A,Sugai H, et al. Dendritic cells pulsed with HER-2/neu-derived peptides can induce specific T-cell responses in patients with gastric cancer[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(11):3394-3400.
[5] Yu P,Lee Y,Liu W,et al. Intratumor depletion of CD4+ cells unmasks tumor immunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors[J]. J Exp Med, 2005, 201(5):779-791.
