肿瘤微卫星异常改变的研究进展
【摘要】 微卫星的异常改变（MSI和LOH）被认为是肿瘤发生的另一机制，MSI和LOH是影响肿瘤临床病理特性的重要因素。微卫星的检测技术简便易行，它可以用于判断预后，检测癌前病变组织。全文就近几年肿瘤微卫星异常改变的有关，阐述了MSI和LOH在肿瘤发生过程中的作用，及其在癌前病变监测和肿瘤防治中的临床意义。
【关键词】 肿瘤
肿瘤分子生物学研究证实，人类肿瘤的本质是一种基因病，其发生机制十分复杂，涉及一系列遗传学改变。微卫星是广泛分布于生物基因组中的DNA重复序列，与许多重要基因紧密连锁[1]。近年来，微卫星分析作为一个敏感的遗传指标，成为肿瘤研究的新热点，现就国内外关于肿瘤微卫星异常改变的研究进展综述如下。
1 微卫星及微卫星异常改变
微卫星（microsatellite, MS）是一种由2~6个核苷酸组成的具有高度多态性的简单串联排列的DNA序列，是一类高度多态性的遗传标记。微卫星序列定位于基因的启动子、基因编码区、内含子及其与外显子交界区，通过改变DNA结构或与特异性蛋白结合而发挥其基因调控作用。据估计，人类基因组携带至少10万个微卫星，约有15 000个标志物覆盖人类所有染色体，可由数据库获取。微卫星异常是基因组不稳定的重要分子标志。主要表现为：①微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)；②杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）。MSI是指肿瘤组织与其相应非肿瘤组织相比，其结构性等位基因的大小发生改变，即微卫星重复单元的增加和丢失。在扩增片段长度多态性分析中，表现为肿瘤组织DNA出现而非肿瘤组织中不出现的额外的带，或肿瘤的一个等位基因与非肿瘤组织相应等位基因相同，而另一等位基因的位置发生改变。肿瘤中微卫星的LOH比MSI更常见，是指一个位点上两个多态性等位基因中的一个出现突变或缺失。通过检测肿瘤细胞染色体上某一区域等位基因位点的缺失，常被用来寻找并定位与肿瘤发生相关的肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG）。目前认为MSI的产生有2种机制[2]：①DNA多聚酶的滑动导致重复序列中1个或多个碱基的错配；②MS同源重组导致碱基对的丢失和插入。现在的研究结果倾向于前一机制。肿瘤组织MSI的诊断目前尚无统一标准。1996年的一个国际会议上对HNPCC及散发性结肠癌MSI判定拟定了1个推荐的标准，在推荐BAT-25、BAT-26、D5S364、D2S125、D17S240这5个MS位点中，当有≥2个位点出现不稳定，为高频率MSI（high-frequent MSI，MSI-H）；出现1个位点不稳定为低频率MSI（low-frequent MSI，MSI-L）；无位点不稳定时判定为肿瘤微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）[3]。LOH是以肿瘤组织中微卫星DNA两种等位基因的相对强度与正常组织的等位基因相对强度的比值（allele ratio，RF）作为判定依据，RF＜0.667或＞1.50时，表示该位点发生了LOH。
目前检测微卫星多态性均采用以PCR为基础的方法。以往微卫星检测利用同位素标记引物、电泳、放射自显影法，该法复杂而繁重。现在国内外多数实验室多采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳—银染方法显示分析结果，其优点在于、方便、检测灵敏度较高。但随着PCR技术的完善和分子生物学技术的不断发展，微卫星检测方法不断更新。毛细血管电泳（capillary electrophoresis，CE）技术是一项成熟的技术，具有操作简便，分辨率和自动化程度高的特点，使大规模、高通量的全基因组扫描得以实现，在基因组研究中已成为一种趋势[4]。荧光标记多重PCR法是采用FAM、TET和AEX 3种不同颜色的荧光染料标记微卫星引物，采用多重PCR方法，将多种引物混合，放入同一管中进行PCR扩增，将PCR产物变性后在同一加样孔中电泳，然后进行测序，软件分析，该法敏感、省时、高效[5]。
2 MSI和LOH参与肿瘤发生发展
通常情况下，体细胞中小卫星DNA基因的突变频率为5×10-2，而微卫星DNA的突变频率为10-7~10-5，因此，微卫星DNA的稳定性可作为衡量细胞基因组整体稳定性的良好标记，并广泛用于肿瘤基因组不稳定性的研究，LOH提示肿瘤抑制基因的缺失和失活，与MSI共同被认为是基因组不稳定的两个主要表型特征，在肿瘤的多步骤发生过程中起着重要作用。产生MSI的主要原因是错配修复（mismatch repair，MMR)功能缺陷，不能正常发挥错配修复作用。MMR缺陷所致的MSI通过DNA的复制和细胞分裂而被保存在基因组中，增加了其他基因的不稳定性，进而出现整个基因组的不稳定性，导致细胞增生及分化异常，从而促进肿瘤的发生。微卫星的杂合性缺失被认为是肿瘤发生机制之一。根据Knudson的抑癌基因失活的“二次打击”假说，发生LOH的染色体区域存在TSG，因此LOH是发现抑癌基因的有效的分子遗传标志[6，7]。抑癌基因的失活常伴有邻近的微卫星多态标记的丢失。通过微卫星标记观察癌组织的某一染色体区域，若出现频发的微卫星标记的LOH，提示目标区域可能存在与所研究肿瘤相关的抑癌基因。微卫星改变分析可以较快地定位肿瘤DNA的丢失及片段DNA长度的改变，研究肿瘤的发生与基因改变的关系，寻找癌变时丢失的抑癌基因，为肿瘤早期诊断、提供细胞遗传学依据。
3 肿瘤微卫星检测的临床应用
3.1 微卫星检测判断癌前病变
微卫星的检测简便易行，不仅可以在组织及血液中检测，甚至可以在其它体液中检测，它还可作为诊断标准，同时更重要的是可用于癌前病变的判断。在肺癌病人的支气管洗液中可以进行微卫星检测，这一报道首先来自于印度。Malhotra P等[8]在对肺鳞癌患者的支气管洗液中，在位于3P的D3S1300及17P的TP53位点进行了微卫星检测，其敏感性分别为35%和45%，比常规检查恶性细胞更有意义（组织中阳性率为15%）。Zhu等[9]利用在乳腺癌中有较高发生率的7个染色体臂的11个微卫星位点，对46例乳腺疾病，包括乳腺增生/乳头状瘤（P/Pap）及乳腺癌患者进行微卫星检测，在22例微卫星改变阳性患者中进行乳头抽吸液（NAF）的MSI及LOH检测，其中P/Pap患者的NAF中LOH/MSI检测阳性率为33%（5/15），乳腺癌患者中为43%（3/7）。证明这一方法可有效检测乳腺癌，NAF中微卫星改变检测可代替在乳腺组织中的检测，成为乳腺癌前病变的重要提示。Rucinska等[10]对20例肉瘤患者的切除标本及其正常组织进行微卫星检测后得出在高级别肉瘤中，位于12P上的位点均检测到MSI，在2号染色体发现有75%的高级别（G3）肉瘤有LOH存在，而在低级别（G1）肉瘤中未发现LOH/MSI，利用这一技术有可能作为鉴别恶性或是非恶性损伤的一个诊断标准。Vassilakis DA等[11]利用10个高的多态性微卫星位点，对26例自发性肺纤维化与26例健康患者的痰液进行对比微卫星检测，50%肺纤维化患者显示出遗传改变，正常组织中未发现LOH/MSI，提示肺纤维化发展为肺癌的风险很高。Luo L等[12]利用微卫星检测研究早期结肠癌的形成，发现与PTPRJ基因相关的微卫星位点发生LOH率最高，提示它在结肠癌发生早期扮演了重要角色。MSI发生在口腔癌前病变早期，而LOH发生频率则随口腔癌前病变的发生发展逐渐增高[13]。
3.2 微卫星检测区别类型
大量研究表明，不同类型的肿瘤易受累的微卫星位点不同，由此提示，出现MSI/LOH的位点可能具有肿瘤的特异性，微卫星标志物可能成为癌症早期诊断的有用标志物。Inoue M等[14]用41个微卫星位点分析40例胸腺肿瘤患者，有77.5%（31/40）的患者在6号染色体有异常改变，分别是6q25.2~6q25.3，6q21.31，6q14.1~6q14.3，6q21，这几个区域内可能存在抑癌基因，参与了胸腺肿瘤的形成。在头颈部肿瘤的研究中，Reis PP等[15]对口腔癌、喉癌及鼻咽癌进行了对比分析，得出在22q上存在缺失情况不同。口腔癌及喉癌的形成与22q上的LOH密切相关。Huang等[16]对胶质细胞瘤的研究中，认为19号和20号染色体部位的缺失与胶质瘤的发生发展密切相关。Starostik P等[17]在胃大细胞B细胞淋巴瘤进行微卫星检测，发现6q上有2个LOH热点，分别位于6q21~6q22.1和6q23.3~6q25。Numasawa H等[18]对口腔鳞癌患者的研究中发现2q的LOH及MSI与口腔鳞癌的发生有密切关系，在D2S1328及D2S206两个位点的区域中，潜伏着一个假定的抑癌基因。翟瑜等[19]在对D3S1067和D18S58两个位点研究后认为D3S1067位点MSI与食管鳞癌关系密切，D18S58与食管小细胞癌的发生关系密切。
3.3 微卫星检测区别分期及转移
研究发现在某些肿瘤中，微卫星异常改变的发生率与临床分期、病理类型、淋巴结转移与否有相关性。宋英那等[20]在8个位点上对40例散发性子宫内膜癌病人进行微卫星检测，36例子宫内膜样癌中，中、低分化者MSI阳性率为50%（5/10），明显高于高分化者的15%（4/26）。张树辉等[21]对56例肝细胞癌（HCC）患者在8号染色体上10个微卫星的异常改变进行检测，其中D8S298和D8S1771基因位点，直径大于3cm肿瘤的LOH率明显高于直径小于3cm组；在D8S1721基因位点，肝内转移者的LOH明显高于无肝内转移者。张舒林等[22]对肺癌的发生及转移与9号染色体微卫星改变的相关性研究中发现伴有淋巴结转移的肺癌组织中微卫星改变检出率为64.7%，不伴转移的肺癌组织中微卫星改变检出率为20%，两组间比较有显著差异 。蔡国响等[23]对71例散发性大肠癌进行MSI检测中发现，微卫星不稳定的散发性大肠癌右半结肠癌和低分化腺癌的比例高于微卫星稳定者。陈国庭等[24]对61例胃癌患者进行微卫星检测，发现MSI-H型胃癌多发生于胃窦部，多见于淋巴结转移阴性，肠型和较早期胃癌。邵华等[25]研究表明，胃癌MSI阳性率为36.67%，与胃癌的分化程度和发生部位有关：高—中分化胃癌MSI-H检出率显著高于低分化胃癌。而姜斌等[26]研究得出MSI发生率在有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者。林兴秋等[27]认为MSI和LOH通过不同途径调控散发性胃癌的发生和转移。MSI是胃癌的早期分子指标之一；而LOH与胃癌高淋巴结转移、预后差的特性相关。研究结果的差异与研究者所选用的微卫星基因位点的种类、数目、研究方法和对MSI阳性的判断标准不同有一定关系。Yang等[28]对17号染色体的D17S396位点进行了nm23H1基因的检测，认为nm23H1基因在卵巢上皮癌中与转移有关，通过增加nm23H1蛋白的表达可以改善其预后。Glaval等[29]对153例头颈鳞癌患者的14个微卫星位点进行研究，发现抑癌基因路径在头颈部鳞癌中起了主导作用，出现MSI的概率较低，在3P，9P，11q，11P均出现高LOH，尤其在11q14.3的LOH与肿瘤的级别密切相关。郭碧赟等[30]通过对急性淋巴细胞性白血病（ALL）的6q上多个位点的检测后认为各位点LOH发生率与周围白细胞数的高低以及骨髓中原始细胞数的高低有显著的相关性，亦即与肿瘤的高负荷性成正比。
3.4 微卫星检测判断预后
Miyai K等[31]对37例宫颈腺癌患者50个微卫星位点，涉及20个染色体臂进行检测，在宫颈癌的发展中伴随多重的染色体臂的经常性的LOH，可能与临床恶化与不良预后有关。Su等[32]在对结肠癌研究中认为ICAM-1基因在预测淋巴结转移上有重要意义。MSI出现在散发性结肠癌早期，而LOH更多的出现在晚期，且与高侵犯性及不良预后有关。Choi等[33]利用40个微卫星位点，在与癌症相关的位于染色体3P，4P，5q，8P，9P，13q，17P和18q上的位点，对168例结直肠癌患者调查了临床病理特征和微卫星改变之间的关系，发现29例MSI-H患者有较好的生存期，而139例患者出现LOH，恶性程度随染色体臂上所涉及的LOH位点增多而增高，反映出在结直肠癌中LOH和MSI可作为一个预后的指标。LOH路径在肝内胆管癌ICC的发生中起主要作用，ICC中OGG1和DCC，VHL基因出现较常见的LOH。无微卫星LOH患者的术后生存率要明显高于有微卫星LOH的患者，而单纯发生MSI的患者其临床预后要相对好于同时伴有LOH的患者[34]。乳腺癌中MSI是一个广泛的现象，且MSI阳性乳腺癌较MSI阴性病例肿瘤体积更大，受累的腋窝淋巴结数更多，组织学分期更晚，且ER、PR阴性的病例出现MSI的比例远高于ER、PR阳性病例。MSI同样参与肺癌的发生发展，MSI阳性者多处于临床晚期，并往往伴有淋巴结转移，预后较差[35]。
4 结 语
肿瘤微卫星的检测技术迅速，应用范围越来越广。利用这一技术，可以寻找到与肿瘤密切相关的抑癌基因，从而精确定位基因位置；通过增加与基因相关的蛋白表达，用于改善癌症患者的预后。但我们应注意到，在检测过程中要避免假阳性结果，提高微卫星的检测精确度及其临床实用价值，从而更准确、客观、高质量的预测肿瘤发病趋势、估计预后和评价效果。
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