金克对乳腺癌裸鼠移植瘤模型生长转移和凋亡的影响

【摘要】  ［目的］ 观察金克（槐耳清膏）对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。［方法］ 以MCF?鄄7细胞复制裸鼠异种乳腺癌移植瘤模型，30只BALB/c荷瘤鼠随机分为对照组（15只）、金克组（15只）。分别用生理盐水（0.2ml/只）和金克(0.2ml/只)连续灌胃30d，观察各组的抑瘤效果及对裸鼠瘤体大小和生存时间的影响。采用光镜、Tunel法行原位凋亡检测、流式细胞术观察肿瘤凋亡的形态学变化。［结果］ ①金克组肿瘤体积大小明显小于对照组（4.62±1.86cm3，6.35±2.73cm3，P<0.01）；②金克组生存期为明显长于对照组（116.7±28.5d，95.3±26.7d，P<0.01）；③原位凋亡检测移植瘤细胞凋亡指数（AI）明显金克组高于对照组，差异有显著性（19.32% vs 8.36%，P<0.01）；④ 流式细胞术显示金克组凋亡比例与对照组差异有显著性（18.21% vs 8.39%，P<0.01）。［结论］ 金克可抑制人乳腺癌细胞MCF?鄄7移植瘤生长，延长生存期。

【关键词】  金克 乳腺肿瘤 移植瘤 凋亡

    金克—槐耳颗粒具有良好的促凋亡效果和免疫增强调节作用，无明显毒副作用。对肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等均有独特疗效[1]。本文主要观察金克对乳腺肿瘤生长的抑制作用，对肿瘤细胞凋亡的影响。

   1   材料与方法

    1．1   材   料

    金克（槐耳清膏）由江苏启东盖天力药业有限公司提供。人乳腺癌细胞株MCF?鄄7购于上海生命院。细胞培养于含血清培养液中，呈贴壁生长。培养细胞置于37℃、5％CO2培养箱中，每3～5天传代1次。实验动物：健康雌性纯种裸鼠，4~6周龄，体重12g~20g，购自湖北省实验动物研究中心（合格证号：SCXK(鄂)2003?鄄0005），饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心。裸鼠置于恒温层流箱中，于无特定病原体（SPF）环境下饲养，12h光照和12h黑夜交替。喂养符合卫生部颁布的“医学实验动物全价营养饲料标准”。

    1．2   方   法

    人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的建立：人乳腺癌细胞株MCF?鄄7在含10％的胎牛血清及160U/L胰岛素的RPMI?鄄1640培养液中培养，传代扩增，收集对数生长期细胞制备悬液，活细胞浓度为1×107/ml。台盼蓝染色计数活细胞占95％以上。SPF环境下进行实验操作，在每只裸鼠背部皮下接种细胞悬液0.1ml/只（含细胞数约0.5×107个）[2,3]。

    动物分组及用药：接种4周后，将裸鼠随机分为对照组和金克组。①对照组：15只，采用灌胃法给药，每天灌注0.9％生理盐水0.2ml/只，共30d。②金克组 15只，每天灌注药物0.2ml/只，其浓度为150mg/ml，共30d。金克组药物剂量相当于人体正常服用金克剂量根据体表面积比值进行换算折合成裸鼠的剂量[4]。

    移植瘤生长情况及药物抑瘤效果：给药后每隔3d用游标卡尺测量肿瘤最大长径（a）、横径（b）。移植瘤的体积＝（a×b2）/2[5]，绘制移植瘤生长曲线。

    移植瘤组织病观察：取移植瘤用4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察。

    裸鼠主要脏器组织学观察：将裸鼠的肝、肺固定，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察有无脏器转移。

    生存期观察：待各组裸鼠衰竭时处死或死亡，记录死亡时间，按公式计算生命延长率：生命延长率（％）＝（金克组平均存活时间－对照组平均存活时间）/对照组平均存活时间×100％。

    凋亡指数（AI）：原位凋亡检测 Tunel法荧光显微镜下初步分析，光镜下避开坏死区，选10个高倍视野（×400倍）凋亡典型区域，计数1 000个细胞，其中阳性细胞数百分比即为AI。

    流式细胞术：待裸鼠衰竭时处死或自然死亡，剥取肿块，用剪刀取部分瘤块，将瘤组织剪碎，并用0.1M PBS液反复冲洗，用200目金属网过滤成单细胞悬液，离心后去掉上清液，再加入0.1M PBS液冲洗，再离心，去掉上清液，加入70％乙醇1ml，边加边振荡。然后上流式细胞仪（FACScan Becton Dickinson，美国），做细胞周期采样分析，检测各组细胞凋亡比例及主要作用细胞分裂的哪个周期。

    1.3   统计学处理

    结果以均数±标准差表示，采用SPSS 12.0统计软件处理，P<0.05为差异有统计学意义。

    2   结   果

    2．1   裸鼠移植瘤生长情况

    30只裸鼠皮下接种MCF?鄄7细胞悬液10d左右，于接种部位皮下均可触及直径约2mm～3mm的瘤块，致瘤率100％。其后肿瘤逐渐长大，28d后移植瘤长径长至0.8cm左右，再分组给予不同的药物处理，此后每3d检测1次移植瘤最大长径和横径，计算移植瘤体积，裸鼠第30d移植瘤平均体积对照组为6.35±2.73cm3；金克组为4.62±1.86cm3，差异有显著性（P<0.01）。显示金克对移植瘤生长有明显的抑制作用。

    2．2   移植瘤组织病变化

    肉眼观察，肿瘤呈圆形、椭圆形或分叶状包块，质地硬，切面呈灰白色。大部分与周围组织分界清楚。对照组中可见4只有胸壁浸润。光镜下对照组移植瘤细胞仍保持培养状态下癌细胞原有的异型性，形状不规则，大小不一，核大浓染，核异型明显，可见病理性核分裂相，核质比例明显增大，可见少量组织坏死区；金克组肿瘤细胞呈现不同程度退行性变，部分肿瘤组织出现明显坏死。提示金克组可显著促进癌细胞坏死。

    2．3   裸鼠生活状况及主要脏器组织学检查

    对照组裸鼠较金克组消瘦明显，在光镜下对其肝、肺脏器组织学观察，发现3只肝部有结节形成，病理证实为移植瘤肝转移；金克组状态良好，光镜下对其肝、肺脏器组织学观察未见有病理学改变，提示用药可以抑制肿瘤转移。

    2．4   两组裸鼠生存期观察

    待裸鼠饲养至衰竭时处死或死亡，记录死亡时间对照组平均存活时间为95.3±26.7d；金克组平均存活时间为116.7±28.5d，生命延长率为22％，金克组与对照组比较差异有显著性（P<0.01）。

    2．5   两组癌细胞凋亡观察

    原位凋亡检测Tunel法检测，光镜下见凋亡细胞核染成棕黄色，金克组AI为19.32%，而对照组AI为8.36%。金克组凋亡指数明显高于对照组（P<0.01），提示金克可诱导乳腺癌细胞发生凋亡（见图1）。

    2．6   流式细胞检测

    流式细胞检测分析结果显示，对照组凋亡比例为8.39%，而金克组凋亡比例为18.21%，差异显著性（P<0.01），并且金克组的G0/G1期分布高于对照组，提示金克可使细胞停滞于G1期，限制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡的发生，诱导乳腺癌细胞发生凋亡。

    3   讨   论

    金克（槐耳清膏）其主要活性成分是多糖蛋白（PST）。对肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等均有独特疗效[6~11]。前期研究显示，金克具有在体外抑制乳腺癌MCF?鄄7细胞生长的作用。我们通过复制人乳腺癌细胞株MCF?鄄7裸鼠移植瘤，进一步观察金克抗癌作用。由于裸鼠无胸腺，仅有胸腺残迹或异常上皮，且这种上皮不能使T细胞正常分化，因而裸鼠缺乏成熟的T淋巴细胞，NK细胞活性亦很低[12]，因此我们通过选取裸鼠为实验材料，可以排除机体免疫调节作用对肿瘤的影响，更好地探讨金克对肿瘤的直接作用。结果显示金克在体内具有明显抑制肿瘤生长的作用。尽管MCF?鄄7细胞株不是高侵袭性的细胞株，但我们仍然观察到对照组4只裸鼠有胸壁浸润，并有3只发生了肝转移，而金克组未发现肿瘤转移现象，反映金克对乳腺癌的浸润生长和转移发生有抑制作用。

    肿瘤不仅是增殖、分化异常的疾病，更是凋亡异常的疾病[13，14]，调控细胞凋亡成为目前肿瘤研究的一个新热点[15]。关于细胞凋亡的检测手段较多，目前认为Tunel法结合了组织化学的方法，定位准确，特异性与敏感性高，假阳性低，可更准确地反映凋亡发生的程度[16]。本实验应用Tunel法可见到金克组有典型的凋亡细胞、凋亡小体或出泡现象，凋亡指数显著高于对照组，说明金克可诱导乳腺癌细胞发生凋亡，抑制肿瘤生长。用流式细胞仪分析两组细胞周期的结果显示金克组的G0/G1期分布高于对照组，表明金克主要作用于G1/S节点，使细胞停滞于G1期，限制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡的发生。

    综上所述，金克具有诱导乳腺癌细胞凋亡，抑制乳腺癌肿瘤的生长和转移发生，延长生存期的作用。但是由于中药的成分复杂，金克的相关作用机制仍然需要进一步的研究和探讨。

【】
  [1] 庄毅.真菌抗癌药物槐耳颗粒的研制[J].肿瘤, 1998, 8(12):540-543.

[2] Kyriazis AP,Di PL, Michael GJ, et al. Growth patterns and metastatic behavior of human tumors growing in athymic mice[J]. Cancer Research, 1978, 38(10):3186-3190.

[3] 田庆锷, 李玛琳. 人肿瘤细胞悬液裸鼠皮下接种及影响移植成功的因素[J].实验动物与管理, 2004, 21(3):47-50.

[4] Ovejeva AA, Houchens DP, Barker AD. Chemotherapy of human tumor xenografts in genetically athymic mice [J]. Ann Clin Lab Sci, 1978, 8(1):50-56.

[5] 贺石林, 陈修. 医学科研方法导论[M]. 北京：人民卫生出版社, 1998. 50－56.

[6] 周启康.金克、噻替派和丝裂霉素C膀胱癌术后运用[J]. 浙江肿瘤, 1998, 49(4):249-250.

[7] 姚亚民, 马智勇, 赵艳秋. 金克在原发性肝癌治疗中的应用[J]. 中国肿瘤, 2000, 9(8):封三.

[8] 姚亚民, 马智勇, 赵艳秋. 金克冲剂合并化疗治疗非小细胞肺癌41例[J]. 中国肿瘤, 2001, 10(3):184-185.

[9] 张铃, 韩风, 马洪波. 金克在原发性肝癌治疗中的应用[J]. 中国肿瘤, 2000, 9(8): 封三.

[10] 刘星野, 周默巍, 徐枫等. 金克槐耳颗粒配合FAM治疗晚期胃癌38例[J]. 浙江肿瘤, 1999, 5(3):189.

[11] Nakazato H, Koike A, Saji S, et al. Efficacy of immunochemotherapy as adjuvant treatment after curative resection of gastric cancer. Study Group of Immunochemotherapy with PSK for Gastric Cancer[J].Lancet,1994, 343(8906):1122-1126.

[12] 陈主初, 吴端生. 实验动物学[M]. 第3版. 北京：人民卫生出版社, 2000. 232－233.

[13] Nomura M, Watari J, Yokota K, et al. Morphogenesis of nonpoly poid colorectal adenomas and early carcinomas assessed by cell proliferation and apoptosis [J]. Virchows Arch, 2000, 437(1):17-24.

[14] Mullauer L, Gruber P, Sebinger D, et al. Mutations in apoptosis genes: a pathogenetic factor for human disease[J]. Mutat Res, 2001, 488(3):211-231.

[15] Brown JM, Wouters BG. Apoplosis, p53, and tumor cell sensitivity to anticancer agents. Cancer Res, 1999,59(7):1391-1399.

[16] Ikeda M, Shomori K, Endo K, et al. Frequent occurrence of apoptosis is an early event in the oncogenesis of human gastric carcinoma[J]. Virchows Arch, 1998, 432(1):43-47.