41.8℃全身热疗对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响

         作者：王远东　吕俊宏　周明　赵建　祈岩超

【摘要】  　　［目的］探讨41.8℃全身热疗对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响。［方法］分别在前后各个不同的时相抽取患者外周血样本，以流式细胞术检测样本中淋巴细胞亚群的百分含量、双抗夹心ELISA法测定血清样本中白细胞介素2（IL2）和白细胞介素受体2（sIL2R）的浓度。［结果］热化疗组患者在热疗期间Th/Ts比值上升至1.7，NK细胞百分含量和血清IL2浓度上升超过3倍，免疫封闭因子sIL2R浓度由热疗前的2 113.3pg/ml显著下降至1 506.5pg/ml，单纯化疗组患者未见上述改变。［结论］ 41.8℃全身热疗发挥的是短期而显著的效应，有助于解除恶性肿瘤患者的免疫抑制，增强机体抗肿瘤免疫作用。

【关键词】  高温, 诱发；免疫　 细胞　肿瘤　辅助疗法　淋巴细胞亚群　白细胞介素2　白细胞介素2受体

　　Effect of 41.8℃ WholeBody Hyperthermia on Cellular Immunity in Patients with Malignancy

        Abstract: ［Purpose］ To investigate the Effects of 41.8℃ WholeBody Hyperthermia on cellular immunity in patients with malignancy. ［Methods］ Peripheral blood samples from patients before and after treatment were detected by flow cytometry for percentage of lymphocyte subsets and ELISA for concentration of IL2 and sIL2R. ［Results］ In patients with hyperthermia and chemotherapy, during treatment withhyperthermia, the Th/Ts radio elevated to 1.7, the percentage of NK cell and IL2 concentration rose to over 3 times and the concentration of sIL2R decreased from 2 113.3 pg/ml before hyperthermia to 1 506.5 pg/ml. The above changes were not observed in patients with chemotherapy alone. ［Conclusion］ 41.8℃ WholeBody Hyperthermia with the transient and conspicuous effect can relieve immune suppression and enhance antitumor immunity in the patients with malignancy.

    Key words: hyperthermia, induced; immunity, cellular; neoplasms; adjuvant therapy; lymphocyte subsets;

    interleukin2; interleukin2 receptors

    interleukin2 receptor，sIL2R）

    热疗已经成为了继手术、放疗、化疗和生物治疗之后又一重要的肿瘤治疗手段。全身热疗（wholebody hyperthermia，WBH）的治疗机制目前还不完全清楚，但其治疗效果已经被假设归因于免疫系统的激活，机体免疫状态的激活对消灭肿瘤起着重要作用。恶性肿瘤患者处于免疫功能抑制状态[1]，而细胞免疫功能紊乱占主要地位。研究表明热疗效果不仅在于高热直接杀死肿瘤细胞，热疗过程机体免疫系统也会发生明显改变，适当温度的WBH可增强机体抗肿瘤的免疫功能[2]，促进白细胞介素2(interleukin 2，IL2)的生成，并使肿瘤局部淋巴细胞浸润增加[3]。为了观察41.8℃WBH对恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响，我们对比了热疗联合化疗与单纯化疗两组恶性肿瘤患者治疗前后各时间点淋巴细胞亚群及血清IL2、可溶性白细胞介素2受体（soluble interleukin2 receptor，sIL2R）水平的变化，从而为热疗的治疗机制和临床应用提供理论与实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象

    恶性肿瘤患者均为广州市肿瘤2004年7月～2005年7月间的住院病人，其中热化疗组25例，男性16例，女性9例，包括直肠癌10例，结肠癌7例，食管癌4例，非小细胞肺癌2例，乳腺癌肺转移1例，小细胞肺癌1例。此组病人均接受41.8℃全身热疗，同时与热疗同步予含铂类药物的化疗。化疗组6例，男性4例，女性2例, 包括直肠癌3例，结肠癌1例，非小细胞肺癌2例，只予含铂类药物的化疗。

    1.2 热疗过程及采血时间

    全身热疗采用ETSPACETMI红外线体表照射全身热疗系统(深圳市一体智能技术有限公司)，热疗过程大约6h，包括4h加热期，60～90min41.8℃的平台期，30～60min的降温期。分别于热疗前或化疗前，热疗平台期末或化疗中，热疗或化疗结束时，热疗后24h或化疗后24h，热疗后48h或化疗后48h，抽取患者外周静脉血3ml，其中1ml置肝素抗凝管即送流式细胞术检测，2ml置无抗凝管即行血清提取后-70℃保存备用。

    1.3 流式细胞术行淋巴细胞亚群分析

    用直接免疫荧光技术测定样本淋巴细胞各亚群细胞百分率，经流式细胞仪(FAC Scan，USA)分析结果。将经肝素抗凝的外周静脉血混匀后取50μl加入含有冻干的已知数量标准荧光微球的绝对计数管（TruCOUNT），加入用异硫氰酸(FITC) 或藻红蛋白(PE)标记的各种小鼠抗人单克隆抗体：FITCCD3/PECD16，56，FITCCD4/PECD8双标记单抗和FITCCD19单标记单抗各20μl(以上仪器和试剂均为Becton Dickinson公司生产), 置室温暗处反应20min后再加入红细胞溶解剂450μl，充分混匀，室温暗处反应30min后上机。经流式细胞计数仪分析CD3+(全T细胞)，CD4+CD8-(辅助T细胞，Th细胞)，CD4-CD8+(抑制T细胞，Ts细胞)，CD16+56+ (杀伤细胞，NK细胞)和CD19+(全B细胞)细胞百分率。

    1.4 酶联免疫吸附试验双抗体夹心法测定血清IL2、sIL2R含量

    采用ELISA双抗体夹心法测定，严格按照试剂盒（由法国DIACLONE公司生产）说明操作，结果由标准曲线查出。

    1.5 统计方法

    实验数据以x±s表示，所有数据均采用SPSS软件分析，统计方法为ANOVA。

    2 结 果

    2.1 各时间点淋巴细胞亚群的变化

    2.1.1 T淋巴细胞亚群的变化

    如表1、2和图1所示，热化疗组病人在热疗期间T淋巴细胞含量包括Th细胞和Ts细胞持续下降，从起始64.7％下降至热疗结束时最低值51.2％，较热疗前有显著性差异（P<0.01），热疗后24h全面恢复接近起始水平，其后的24h又显著下降，其中Th细胞与Ts细胞的变化趋势相类似，但Th/Ts比值在热疗期间持续上升，至热疗结束时达到高峰1.7，热疗后48h内逐渐下降至起始水平；化疗组病人在化疗期间Th细胞和Ts细胞含量均有下降，Th细胞在化疗后逐渐上升，至化疗后48h已高于起始水平，而Ts细胞在各时间点均稍低于起始值，Th/Ts比值只是在化疗中小升至1.53，无统计学差异（P>0.05）。

    2.1.2 NK细胞的变化

    由表1、2和图2可见，热疗作用使热化疗组病人的NK细胞含量由起始的18%陡升至54%，显著高于其他时间点（P<0.01），并随着体温的下降而恢复至起始水平，热疗后仍有缓慢上升；化疗组病人NK细胞含量变化不大，在各时间点无显著性差异（P>0.05）。

    2.1.3 B细胞的变化

    两组病人的B细胞含量受热化疗或化疗的影响不大，在各时间点无显著性差异（P>0.05）。

    2.2 各时间点血清IL2、IL2R的变化

    2.2.1 血清IL2的变化

    如表3、4和图3所示, 热疗作用使热化疗组病人血清中IL2浓度由起始的7.1 pg/ml上升至21.8 pg/ml，较热疗前显著升高（P<0.01），在热化疗后48h依然保持16 pg/ml的浓度，也显著高于热疗前（P<0.01）；而化疗组病人血清IL2浓度则持续下降，由化疗前的9.2pg/ml降到化疗后48h的2.5 pg/ml。

    2.2.2 sIL2R的变化

    如表3、4和图4所示, sIL2R的浓度在热化疗作用下与IL2的变化相反，由热疗前的2 113.3 pg/ml显著下降至热疗中1 506.5 pg/ml（P<0.01），并随着温度的下降逐渐上升，直至热疗后48h达到2 971.4pg/ml的高峰。而化疗组病人在化疗中明显上升至2 578pg/ml，显著高于化疗前（P<0.01）。

    3 讨 论

    用各种方法提高全身和（或）肿瘤组织（局部）的温度，利用热作用及其继发效应来恶性肿瘤，称为肿瘤热疗（hyperthermia）。大量研究表明，WBH的抗肿瘤作用并不是因为热效应对肿瘤细胞的直接杀伤，其主要作用包括：增强机体免疫系统的功能、抑制肿瘤的生长和转移、增强其它肿瘤治疗方法(如化疗、放疗等)的效果等。

    机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，其中Ｔ淋巴细胞亚群起主导作用[4]，CD4+细胞代表辅助性T细胞(Th)，CD8+则是细胞毒T淋巴细胞（CTL）和抑制性T(TS)细胞的共同标志[5]，Th细胞依赖抗原呈递细胞呈递相关的肿瘤抗原，被其特异性激活后分泌淋巴因子导致肿瘤细胞的损伤或溶解死亡，TS细胞通过分泌γ干扰素（IFNγ）抑制IgG1的产生而发挥免疫抑制作用。我们看到41.8℃WBH期间T细胞含量包括CD4＋细胞和CD8＋细胞全面下降，但CD4＋/CD8＋比值呈上升趋势，幅度高于化疗组，热疗后才开始回降。而单纯化疗的患者CD4＋细胞和CD8＋细胞在化疗期间及其后的48h内变化无统计学差异，CD4＋/CD8＋比值只是在化疗中稍有上升，提示41.8℃WBH可使CD4＋/CD8＋比值有所上调，但效应是短暂的，随着体温恢复而下降，与[2]报道一致。在以往的体外实验中，温度的升高可诱导正常淋巴细胞的程序性死亡，体内实验则证明，WBH期间淋巴细胞总数、CD4+T细胞, CD8+T细胞的凋亡率上升，推测外周血T淋巴细胞总数下降可能与热疗诱导淋巴细胞的凋亡有关，本实验也能观察到类似现象。

    杀伤（natural killer cell, NK）细胞可直接或间接诱导靶细胞凋亡，被视为机体免疫防御系统的第一道防线[6]。CD16+56+是NK细胞的标志，本研究可看到CD16+56+细胞含量受体温的影响非常显著，41.8℃WBH使恶性肿瘤患者的CD16+56+细胞呈早期而短程的明显升高，并随体温的下降而回降，热疗后48h内无明显上升，结果与Dieing等[7]的报道类同，而化疗组患者的CD16+56+细胞则看不到如此的变化。可见41.8℃WBH 可能通过上调NK细胞的数量与活性发挥抗肿瘤效应。

    IL2是由辅助性Ｔ细胞产生的一种免疫调节因子，在抗肿瘤免疫反应中发挥非常重要的作用。它通过细胞膜上IL2受体(mIL2R)与细胞相互作用，从而刺激T细胞生长，参与NK细胞、LAK细胞杀瘤活性的激活。sIL2R是近年来公认的免疫封闭因子，sIL2R系由mIL2R oc链部分脱落而成，它的释放使mIL2R减少，促使活性细胞恢复到休止期，同时sIL2R与mIL2R竞争结合IL2，封闭IL2的刺激淋巴细胞及克隆增殖作用，起一定的免疫抑制效应。国外众多研究[8~10]表明IL2/sIL2R系统的水平有助于肿瘤患者的病情监测，疗效观察及预后判断，sIL2R水平越高，常提示患者的病情较重，预后越差。我们的实验表明41.8℃WBH使恶性肿瘤患者外周血IL2的浓度显著上升3倍以上，sIL2R浓度从2 113pg/ml下降至1 506pg/ml，均有显著性差异（P<0.01），复温过程IL2即逐渐回降，sIL2R则马上上升，热疗后48h内IL2的浓度仍然高于起始值，并仍缓慢上升， sIL2R则继续显著上升，而化疗组患者IL2/sIL2R系统则没有出现上述变化，说明恶性肿瘤患者体内的IL2/sIL2R系统水平受热效应影响明显并灵敏，这与Atanackovic[2]的研究一致。

    综上所述，41.8℃WBH发挥的是短期而显著的效应，能够使恶性肿瘤患者Th/Ts比值上升，NK细胞含量、血清IL2浓度显著提高，免疫封闭因子sIL2R浓度显著下调，有助于解除恶性肿瘤病人的免疫抑制，达到增强机体抗肿瘤免疫作用。

【文献】
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[2]Atanackovic D, Nierhaus A, Neumeier M, et al. 41.8℃ degrees whole body hyperthermia as an adjunct to chemotherapy induces prolonged T cell activation in patients with various malignant diseases[J]. Cancer Immunol Immunother, 2002,51(11-12):603-613.

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[5]Yamaoka K, Mitsunobu F, Hanamoto K, et al. Biochemical comparison between radon effects and thermal effects on humans in radon hot spring therapy[J]. J Radiat Res (Tokyo), 2004,45(1):83-88.

[6] Papamichail M, Perez SA, Gritzapis AD, et al. Natural killer lymphocytes: biology, development and function[J]. Cancer Immunol Immunother, 2004,53(3):176-186.

[7]Dieing A, Ahlers O, Kerner T, et al. Whole body hyperthermia induces apoptosis in subpopulations of blood lymphocytes[J]. Immunobiology, 2003,207(4):265-273.

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