表没食子儿茶素没食子酸酯诱导人胃癌BGC823细胞凋亡
作者：邹少娜，文小玲，刘晓萍，陈晓艳，王强，罗招阳
【摘要】 ［目的］ 观察表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）诱导人胃癌BGC823细胞凋亡的生物学效应及分子机制。［方法］ 通过MTT法检测EGCG对BGC823细胞生长的影响；用形态学观察、流式细胞术和DNA琼脂糖凝胶电泳研究EGCG诱导BGC823细胞凋亡。Western blot法检测EGCG处理后BGC823细胞NF-κB(p65)、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达。［结果］ EGCG显著性抑制BGC823细胞的生长，呈浓度依赖性。EGCG处理后，光镜下细胞呈典型的凋亡形态学改变；流式细胞术分析表明不同浓度EGCG处理48h后，亚G1期细胞逐渐增加；EGCG（80μg/ml）作用48、72h后，DNA凝胶电泳出现典型梯形条带；Western blot表明EGCG处理48h后，NF-κB(p65)和Bcl-2蛋白表达下调，Bax和Caspase-3蛋白表达升高。［结论］ EGCG具有诱导人胃癌BGC823细胞凋亡的作用，其机制可能与抑制NF-κB活化，导致Bax/Bcl-2比值上调，促进Caspase-3活化有关。
【关键词】 胃肿瘤
茶叶的主要成分茶多酚(tea polyphenols)具有抗肿瘤作用。茶多酚由几种结构相似的多酚类化合物组成，包括表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG），表没食子儿茶素（epigallocatechin， EGC），表儿茶素没食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）和表儿茶素（epicatechin，EC）等。在这几种单体中，EGCG的含量最丰富，应用价值最大[1]。
细胞凋亡调控的失调是导致肿瘤形成的一个重要条件[2]。近年研究表明，EGCG可在体内外引起多种肿瘤细胞的生长抑制和凋亡[3~6]，通过抑制NF-κB的活性能引起肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中的重要成员，bcl-2抑制细胞凋亡，bax与bcl-2的作用相反，具有诱导细胞凋亡的功能，两者的比例决定细胞的生死，如bcl-2过量，形成bcl-2二聚体，细胞就存活；如bax过量，形成bax二聚体，细胞就走向凋亡。活化后的Caspase-3具有在天冬氨酸残基后切断肽键的能力，可使细胞质、细胞核、细胞骨架的重要蛋白质降解失活，是执行哺乳动物细胞凋亡的最关键的酶之一。本文主要验证EGCG是否通过抑制人胃癌BGC823细胞核转录因子NF-κB活化，导致Bax/Bcl-2的比值的上调，促进Caspase-3的活化，诱导细胞凋亡。
1 材料与方法
1.1 细胞及细胞培养
人胃癌细胞BGC823由中科院上海细胞生物学研究所引进。用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃，含5%CO2的饱合湿度的培养箱内培养传代。
1.2 药品与试剂
EGCG：Sigma公司产品，纯度95%。小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品，MTT为Amresco公司产品；细胞凋亡DNA Ladder检测试剂盒为北京博大泰克生物基因技术有限责任公司产品；Caspase-3、NF-κB(p65)、Bcl-2和Bax抗体为Santa Cruz公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG为武汉博士德生物有限公司产品。
1.3 MTT比色法测定
取对数生长期细胞，接种于96孔平底培养板，每孔180μl(含0.9×104细胞)。培养6h后加入处理因素并设本底对照组、空白对照，使EGCG的终浓度为 20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml每组设4个平行孔，继续培养48h。然后每孔加入MTT 20μl（5mg/ml），4h后即终止培养，弃上清液，每孔加入200μl DMSO，振荡摇匀，置酶联免疫检测仪在570nm波长处测量吸光度（A）值。按以下公式细胞增殖抑制率：抑制率（IR%）=（1-试验组A值/对照组A值）×100%。
1.4 细胞形态学观察
按常规方法制备细胞爬片，用HE染色，光镜下观察细胞形态学改变。
1.5 琼脂糖凝胶电泳
按DNA Ladder检测试剂盒说明抽提DNA，取样品5μl于2%琼脂糖凝胶电泳（8V/cm，2h），紫外凝胶成像系统下观察并照相。
1.6 流式细胞术分析
0.25%胰蛋白酶消化，收集培养细胞，PBS洗2次，每次4℃ 800r/min 离心5min，去上清液后加入4℃ PBS 0.5ml，充分混匀悬浮细胞，计数制成约1×106细胞/ml×1ml的单细胞悬液。用4℃预冷的70%乙醇2ml固定细胞（4℃，48h~72h）充分混匀。固定细胞用PBS洗2次，加RNA 酶50μl（浓度为0.5mg/ml），37℃水浴30min，加碘化丙啶（PI）50μl，浓度为1mg/ml，振荡混匀，避光置冰箱30min，300目尼龙网滤过，上机检测，计数10 000个细胞，进行细胞周期和DNA含量分析。
1.7 Western blot 分析
取对数生长期的BGC823细胞，经EGCG 20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml处理48h后，用1×PBS洗3~4次后，细胞裂解液（50mM Tris-Cl pH7.5，150mM NaCl，10ml/LNP40，1mg/ml SDS，10g/L脱氧胆酸钠，1mM DTT，1mM PMSF，25μg/ml 亮抑素，25μg/ml胰蛋白抑制剂）4℃裂解30min，超声碎裂30s，13 000r/min，离心去细胞碎片，留含有全蛋白的上清液。用BCA assay reagent测定蛋白浓度，50μg蛋白与加样缓冲液混合，100℃变性5min，在10%不连续SDS-PAGE胶中电泳分离，电转移至PVDF膜，膜与一抗孵育12h，二抗孵育1h，用ECL发光法显色、曝光、显影、定影、水洗。胶片采用薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。
1.8 统计学处理
采用SPSS10.0统计学软件，实验结果（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，有显著差异者进一步用最小显著差值法进行两两比较。P＜0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 EGCG对BGC823细胞生长的抑制作用
MTT比色法测定结果显示：EGCG显著性抑制BGC823细胞的增殖活性，呈剂量依赖性。EGCG 20、40、60、80、100μg/ml作用BGC823细胞48h，其抑制率分别为29.04%±2.4%、48.44%±3.7%、62.51%±3.1%、72.97%±2.9%、79.29%±5.4%。EGCG作用BGC823细胞48h的IC50为39.9±2.6μg/ml（见图1）。
2.2 EGCG对BGC823细胞凋亡的影响
2.2.1 细胞凋亡形态学观察
在光镜下，HE染色，未处理的BGC823细胞胞浆染成红色，胞核染成蓝色，细胞胞浆少，核浆比例大。经40μg/ml EGCG处理48h后，BGC823细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，核染色质固缩积聚至核膜周边，核深染，见图2。
2.2.2 PI染色FCM分析
流式细胞术检测结果显示：未处理的BGC823细胞48h凋亡率为1.8%±0.2%，用20、40、80μg/ml EGCG作用48h，凋亡率分别为9.8%±1.9%、15.7%±1.3%、32.1%±2.4%，凋亡率随浓度的增高而增高（P＜0.05）。
2.2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳
EGCG作用BGC823细胞后，可诱导BGC823细胞产生凋亡细胞的典型DNA梯形条带。以80μg/ml EGCG作用BGC823细胞24、48和72h来观察不同时间EGCG诱导DNA断裂。当EGCG作用BGC823细胞24h时，未见DNA梯形条带，时间延长至48h、72h时，DNA梯形条带清晰（图3）。
2.3 EGCG对BGC823细胞NF-κB(p65)、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响
Western blot检测不同浓度的EGCG（20、40、80μg/ml）作用于BGC823细胞48h后NF-κB(p65)、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的变化。EGCG（20、40、80μg/ml）处理组NF-κB(p65)、Bcl-2蛋白表达均较对照组降低；EGCG（20、40、80μg/ml）处理组Bax和Caspase-3蛋白表达均较对照组有明显增强，EGCG处理组的平均光密度值与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）。
3 讨 论
细胞凋亡是在特定时空中发生的受机体严格调控的程序化细胞死亡过程。主要有染色质浓缩、凋亡小体出现、亚二倍体峰形成及电泳呈现梯形DNA条带等典型的形态学和生化特征。本文实验结果表明，EGCG处理的BGC823细胞出现细胞变圆、皱缩，核染色质固缩、积聚至核膜周边，核深染等典型凋亡细胞形态特征；流式细胞术检测可见明显的亚二倍体峰；琼脂糖凝胶电泳呈现DNA梯形条带，证实EGCG具有诱导人胃癌BGC823细胞凋亡作用。
研究表明，EGCG诱导肿瘤细胞凋亡与多条信号途径相关[7]，NF-κB在肿瘤细胞的凋亡中起到重要作用[8]。核转录因子NF-κB的下调，促使与抗凋亡相关的NF-κB靶基因如TRAF1等表达减弱，从而促进凋亡。已经证实，EGCG可以抑制IKKα蛋白表达，抑制IκBα磷酸化，导致p65的核移位阻滞，从而抑制NF-κB活化[9]。
Bcl-2家族是含有Bcl-2同源结构域（BH）的细胞凋亡调节元件。目前研究的最为深入的Bcl-2 蛋白，其抗凋亡活性主要是与Cytc/Apaf-1-caspase-9通路有关。Bcl-2可抑制在凋亡过程中本由线粒体中释放并与Apaf-1结合的Cytc，从而阻断了Cytc/Apaf-1复合物激活Caspase-9酶原的过程。而Bax和Bad可以形成异源二聚体灭活Bcl-2，从而促进凋亡。研究表明，EGCG体外诱导鼠乳腺癌4T1细胞凋亡与Bcl-2的下调及Bax的上调、细胞色素C的释放、Apaf-1的上调、Caspase-3的剪切相关[10]。
Caspase-3是细胞凋亡的执行者，它可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡。效应性Caspase激活后主要从以下几个方面导致细胞凋亡：①激活凋亡特异性核酸酶，即Caspase活化的DNA酶(Caspase-activated DNase，CAD)。当Caspase-3被激活后可以灭活ICAD，游离出有活性的CAD，而水解DNA导致细胞凋亡的发生。②降解细胞骨架蛋白。③裂解DNA修复的关键酶——多聚ADP核糖多聚酶[poly(ADP-ribose) polymerise，PARP]等。药物通过Caspase-3途径诱导肿瘤细胞凋亡时，一方面是促进Caspase-3蛋白的表达[11]，另一方面是促进Caspase-3的活化[12]。
本文实验发现：EGCG抑制体外培养的人胃癌BGC823细胞核转录因子NF-κB活化，下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，促进Caspase-3的活化。提示：EGCG通过诱导细胞凋亡作用抑制人胃癌细胞生长与其抑制人胃癌BGC823细胞核转录因子NF-κB活化，下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，导致 Bcl-2家族中Bax/Bcl-2比值的上调，从而促进Caspase-3的表达有关。
【】
[1] Fujiki H. Green tea: Health benefits as cancer preventive for humans[J]. Chem Rec, 2005,5(3):119-132.
[2] Boris Zhivotovsky,Sten Orrenius.Carcinogenesis and apoptosis: paradigms and paradoxes[J]. Carcinogenesis, 2006, 27(10):1939-1945.
[3] Qanungo S,Das M, Haldar S, et al. Epigallocatechin-3-gallate induces mitochondrial membrane depolarization and caspase-dependent apoptosis in pancreatic cancer cells[J]. Carcinogenesis, 2005, 26(5):958-967.
[4] Noguchi M,Yokoyama M, Watanabe S, et al. Inhibitory effect of the tea polyphenol, (-)-epigallocatechin gallate, on growth of cervical adenocarcinoma cell lines[J]. Cancer Lett, 2006, 234(2):135-142.
[5] Stuart EC, Scandlyn MJ, Rosengren RJ. Role of epigallocatechin gallate (EGCG) in the treatment of breast and prostate cancer[J]. Life Sci, 2006,79(25):2329-2336.
[6] Horie N,Hirabayashi N, Takahashi Y, et al. Synergistic effect of green tea catechins on cell growth and apoptosis induction in gastric carcinoma cells[J]. Biol Pharm Bull, 2005, 28(4):574-579.
[7] Khan N, Afaq F, Saleem M, et al. Targeting multiple signaling pathways by green tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate[J]. Cancer Res, 2006, 66(5):2500-2505.
[8] Kucharczak J, Simmons MJ, Fan Y, et al. To be, or not to be:NF-kappaB is the answer—role of Rel/NF-kappaB in regulation of apoptosis[J]. Oncogene,2003,22（56）:8961-8982.
[9] Yan Z, Yong-Guang T, Fei-Jun L, et al. Interference effect of epigallocatechin-3-gallate on targets of nuclear factor kappaB signal transduction pathways activated by EB virus encoded latent membrane protein1[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(8):1473-1481.
[10] Baliga MS, Meleth S, Kativar SK. Growth inhibitory and antimetastatic effect of green tea polyphenols on metastasis-specific mouse mammary carcinoma 4T1 cells in vitro and in vivo systems [J]. Clin Cancer Res,2005,11(5):1918-1927.
[11] Lu HF, Sue CC, Yu CS, et al. Diallyl disulfide induced apoptosis undergo caspase-3 activity in human bladder cancer T24 cells Food[J]. Chem Toxicol, 2004, 42 (10):1543-1552.
[12] Hofmanova J,Vaculova A, Kozubik A. Polyunsaturated fatty acids sensitize human colon adenocarcinoma HT-29 cells to death receptor-mediated apoptosis[J]. Cancer Lett, 2005, 218(1):33-41.
