低氧条件下大鼠视网膜HIF-1α及P53的表达及相关分析
作者：张薇，李若溪，许建华，刘哲丽
【摘要】 目的：探讨低氧条件下HIF-1α及P53在大鼠视网膜的表达及相关性。方法：将大鼠56只随机分为2组，每组各28只，分别饲养于常氧和50mL/L低氧仓。于饲养后0，2，6，8，12，24， 48h 各处死4只，分别进行光镜,电镜 ,免疫组化（SABC）测定HIF-1α及P53表达，并进行相关性分析。 结果: HIF-1α在缺氧后2h开始表达，8h达到高峰，12～24h持续强表达，48h表达明显下降。P53在缺氧后2h开始表达，以后表达逐渐升高，24h后表达达到高峰，48h表达明显下降。HIF-1α及P53在大鼠视网膜表达呈明显正相关（R =0.902495）。电镜结果显示在视网膜缺氧6h视网膜超微结构开始变化，24h凋亡达到高峰。结论：低氧条件下HIF-1α及P53在大鼠视网膜均有表达，随着HIF-1α的表达达到高峰后P53的表达达到高峰，两者呈明显正相关。P53表达达到高峰时电镜结果显示凋亡达到高峰。
【关键词】 低氧诱导因子-1α P53 视网膜低氧 大鼠
0引言
低氧使细胞的生理功能发生改变，造成全身组织、器官失灌而损伤。 低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1, HIF-1)是1992年由Semenza等发现的。HIF-1可调控促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、糖酵解酶等多种基因的表达。视网膜细胞代谢的最大特点是耗氧多,对缺氧特别敏感，目前没有整体低氧情况下视网膜细胞HIF-1α表达的研究报道，也没有HIF-lα参与低氧视网膜细胞凋亡的证据。我们研究大鼠视网膜细胞缺氧后不同时间的HIF-lα，P53的表达，应用免疫组织化学技术，对低氧情况下视网膜细胞内HIF-1α及P53的蛋白表达进行了定量分析，探讨低氧环境下HIF-1α与P53的关系。并对视网膜超微结构进行电镜观察。
1材料和方法
1.1材料 常压低氧模型有机玻璃制成低氧仓，体积100cm×60cm×60cm有机玻璃厚4cm，三氯甲烷封侧面，以便开仓取换食物、水及取鼠。仓体上面开一直径1 cm的出气孔，侧面开一直径1cm的进气孔。通过三通管分别按氮气和压缩空气。用玻璃转子流量计（沈阳市北量流量仪器厂）控制流量。成年Wistar大鼠56只，雌雄不限。医科大学实验动物学部提供，质量170～220g随机分为2组，每组各28只，分别饲养于常氧环境，50mL/L低氧仓。于饲养后0，2，6，8，12，24，48h处死4只，分别进行光镜,电镜，免疫组化测定HIF-1α及P53表达。 兔抗鼠HIF-1α、P53抗体，免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2方法
1.2.1免疫组织化学实验 大鼠处死后立即摘除眼球投入固定液（固定液配置：无水乙醇60mL，甲醇10mL 冰醋酸10mL，氯仿20mL）固定2h。室温脱水，整个眼球投入600，700，800，900，950mL/L乙醇各10min取出眼球用锋利刀片沿角膜两侧由后向前平行视轴剖切，包括角膜，晶状体，视神经，然后投入无水乙醇10min。硬脂酸：蜡1（3:7）2h；硬脂酸：蜡2（2:8）1h；石蜡3h（熔点52℃）。石蜡包埋，切片染色浸蜡后的眼球水平面朝向包埋框底，用石蜡蜂蜡混合包埋，冷却后切片机切片厚4μm。石蜡切片烤干，常规脱蜡至水，过氧化氢封闭阻断内源性过氧化物酶，Hci进行抗原修复，羊血清封闭电荷，阻断非特异性抗原抗体结合，弃去液体不洗。分别滴加一抗（HIF-1α抗体的工作浓度1：200，P53抗体的工作浓度1：200），4℃冰箱过夜。PBS(0.01mol/L pH7.2~7.4)洗后滴加FITC标记羊抗兔IgG(工作浓度1：1 000)，PBS冲洗，孵育，染色，DAB显色，苏木素复染，晾干，脱水，透明，封片PBS代替一抗做阴性对照。
1.2.2透射电镜操作 大鼠处死后取眼球，20mL/L戊二醛浸泡至少2h，经前固定，清洗，后固定，脱水，浸透，包埋，超薄切片后柠檬酸铅和醋酸钠进行双染色。观察并摄片。细胞核或胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为HIF-1α阳性表达细胞，细胞核或胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为P53阳性表达细胞，无阳性反应为阴性。在40倍物镜下摄取每组随机选取的视网膜切片，每张随机选取2个视野，转入机用Metamorph软件设定出阳性细胞阈值，并设定阳性框区。计算框区阳性细胞平均积分吸光度IOD值判定阳性细胞的表达情况。
统计学处理：分析软件用SPSS 10.0。
2结果
2.1 HIF-1α及P53的表达 常氧条件下各时间点HIF-1α及P53的表达极为微弱，缺氧24h P53的免疫组化的照片可见节细胞层强表达,内颗粒层有表达,外颗粒层少有表达(图1A)。缺氧8h HIF-1α免疫组化的照片可见节细胞层强表达,内颗粒层有表达,外颗粒层少量表达（图1B）。 缺氧2h即出现HIF-1α表达，随着时间延长表达逐渐增加。8h基本达到高峰，12～24h持续强表达，48h表达明显下降。缺氧2h即出现P53表达，随着时间延长表达逐渐增加。8h明显表达增强，24h基本达到高峰，以后下降（表1)。缺氧条件下HIF-1α及P53表达呈曲线变化（图2）。
图1 缺氧后HIF-1α及P53的表达。A：缺氧24h P53的免疫组化的照片可见节细胞层强表达,内颗粒层有表达,外颗粒层少有表达；B：缺氧8hHIF-1α免疫组化的照片可见节细胞层强表达,内颗粒层有表达,外颗粒层少量表达
图2 HIF-1α和P53表达的相关性图示。由上图得知HIF-1α和P53表达呈正相关（r =0.902495 ）
2.2电镜结果 对照组光镜下未见明显异常，透射电镜下各层组织区分明显,细胞核仁明显,居中,核膜清晰,细胞器较多,结构清楚。神经节细胞无变性，线粒体嵴存在，粗滑面内质网无变性，粗面内质网无脱颗粒，神经纤维无水肿，而随着缺氧时间延长，6h出现超微结构变化，线粒体轻度膨胀，内质网有轻度扩张（图3A），24h出现神经节细胞变性，线粒体明显膨胀，嵴消失，滑面内质网扩张，粗面内质网脱颗粒扩张，内核层及内外丛状层中线粒体膨胀，核仁靠近核膜,细胞有损伤的变化。神经纤维层轴突水肿加重，结构疏松，但视锥，视杆细胞较完整，（图3B）。
图3电镜结果。A：缺氧6h后视网膜电镜改变:线粒体轻度膨胀，内质网有轻度扩张TEM×5 000；B：缺氧24h视网膜电镜改变:可见胞质空泡化，线粒体明显膨胀，嵴消失，滑面内质网扩张，核仁靠近核膜,细胞有损伤的变化TEM×6 000
3讨论
视网膜对缺氧极其敏感，缺氧能造成许多眼底疾病如糖尿病性视网膜病变[1]，视网膜中央静脉阻塞(缺血型) ,视网膜中央动脉阻塞等,而细胞内氧的消耗主要功能是被细胞内线粒体的氧化磷酸化的过程所利用[2],而且约10 %～15 %的细胞内一些酶的活动也需要氧分子参加，所以缺氧不仅导致细胞内线粒体氧化磷酸化的抑制，同时也将抑制细胞内一些需要氧的正常反应代谢过程。
HIF-1是在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的一种DNA 结合蛋白，是被公认的缺氧调节中的重要因子。HIF-1是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种异源二聚体核转录因子，由α亚基(HIF-1α)和β亚基 (HIF-1β)组成。HIF-1α是唯一的Ｏ2调节亚单位，决定HIF -1α的活性， 通过对VEGF 等下游基因的调节而产生一系列代偿反应，以适应低氧环境[3-5]。在常氧情况下HIF-1α半衰期小于1min，通过泛素、蛋白酶体途径降解，缺氧降低泛素化或通过突变阻断泛素化而增加HIF-1α的表达。HIF-1α与缺氧诱导因子抑制因子结合，而被降解；缺氧条件下，由于降解通路被阻断，HIF-1α迅速与HIF-1β聚合形成有活性的HIF-1 二聚体，从而调节下游基因的表达。我们的研究发现，缺氧可以明显增加大鼠视网膜神经细胞HIF-1蛋白的表达[6 ] 。并调控它的下游基因P53的表达，从本实验看随着HIF-1α的表达达到高峰后P53的表达达到高峰，两者呈明显正相关.
HIF-1α是机体生存必需的维持氧稳态的主要调节因子。从胚胎发育早期到成年期一直到衰老，HIF-1α精细地调节着许多生物反应。HIF-1α是机体生存必需的维持氧稳态的主要调节因子[7,8]。有研究表明氧浓度的改变，可以直接调控HIF-1α的活性，最近又发现MDM2泛素蛋白连接酶的识别靶标P53也能与HIF-1α亚基结合，从而介导HIF-1α亚基的降解。由于缺氧细胞中P53的表达升高，这样即可避免HIF-1α亚基在缺氧条件下的过量积累[9]，又可激活结构域结合蛋白1，直接与HIF-1α亚基结合,抑制P53与HIF-1α亚基的结合，从而抑制P53对HIF-1α亚基稳定性的负调节,增加ＨＩＦ-1α亚基的表达[10,11]。这样P53与Jab1协同调节缺氧条件下HIF-1α亚基的表达，有效地避免了HIF-1α亚基的过量表达。从本实验看随着P53的表达达到高峰HIF-1α的表达逐渐降低，同以上观点相符。由此可见P53和HIF-1α之间有着微妙的关系。
缺氧是P53最强的生理性诱导剂,缺氧情况下,去磷酸化的HIF-1α通过与P53结合可介导缺氧情况下P53依赖的凋亡[9]。P53也参加了HIF-1α的调节。本研究结果支持这一观点。HIF-1α的表达与P53蛋白表达之间呈显著正相关(ｒ=0.902495)。该结果提示HIF-1α和P53可能协同参与了缺氧对视网膜神经细胞的调节,缺氧一方面使HIF-1α表达增加,提高视网膜能量代谢和血管生成,另一方面可能通过对P53的选择,使视网膜神经细胞发生凋亡。通过电镜可见凋亡高峰的出现同P53表达高峰的出现相符合。
本实验只是对HIF-1α和P53的一个粗浅的研究，更深更细的研究有待于下一步进行。
【】
1李媛,卢燕.糖尿病视网膜病变早期发病机制研究进展.国际眼科杂志,2005;5(4):750-754
2 Luo X, Lambrou GN, Sahel JA, Hicks D. Hypoglycemia induced general neuroal death whereas hypoxia and glutamate transport blockade lead to selective retinal ganglion cell death in vitro . Invest Ophthalmol Vis Sci ,2001;42(11):2695-2705
3 Ren XQ, Meng JM, Fu KD. Study on relationship between expression of p53, H IF-1α and angiogengesis of colorectal carcinoma. Zhongguo Yixue Gongcheng ,2004;12(4):31-35
4 Semenza GL. Expression of hypoxia inducible factor-1α echanisms and consequences. Biochem Pharmacology ,2000;59:47-53
5宋虎平,惠延年,王丽丽,韩晓霞,王海燕.缺氧诱导因子-1α在早期糖尿病大鼠角膜上皮细胞中的表达.国际眼科杂志,2006;6(2):352-356
6张红,栾洁.眼内新生血管与细胞因子.国际眼科杂志,2006;6(1):158-163
7 Kallio PJ, WilsonWJ, O’Brien S,Makino Y, Poellinger L. Regulation of the hypoxia inducible transcription factor 1 alpha by the ubiquitin proteasome pathway. J Biol Chem ,1999;274: 6519-6525
8 Semenza GL. H IF-1α, and the 3 PHDs: how animal cells signal hypoxia to the nucleus. Cell ,2001;107:123
9 Rudzinski M, Wong TP, Saragovi HU. Changes in retinal expression of neurotrophins and neurotrophin receptors induced by ocular hypertension. J Neurobiol ,2004;58(3):341-354
10 Vannucci RC, Towfighi J, Vannucci SJ. Hypoxic preconditioning and hypoxic—ischemic brain damage in the immature rat: pathologic and metabolic correlates. J Neurochem ,1998;71:1215
11苟琳,张作明,郭守一,张萍,李丽,郭群.缺氧对视网膜Müller 细胞超微结构及GFAP 表达的影响.第四军医大学学报,2002;23(5):472-475
