缺氧下外源性血管内皮生长因子对体外大鼠Müller细胞的影响
作者：刘晓娟 惠延年 郭斌 张乐 郝晓凤
【摘要】 目的：观察缺氧条件下外源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外大鼠Müller细胞的影响。方法：体外酶消化法纯化培养并鉴定大鼠Müller细胞。台盼兰染色测定细胞活性。应用光镜、细胞计数、免疫细胞化学、MTT法、原位细胞凋亡等方法分析Müller细胞在不同的缺氧时间（0~24 h）、添加不同浓度VEGF（10～100 μg/L）及VEGF受体Flk-1阻断剂SU1498处理后，细胞中VEGF和Flk-1，Flt-1的表达、细胞活性及凋亡等变化。 结果：纯化培养至第3代的Müller细胞，经鉴定其纯度为90%，活力是87.3%。缺氧8～12h时Müller细胞胶质源纤维酸性蛋白（GFAP）染色增强，VEGF和Flk-1，Flt-1表达增加，可见细胞肿胀、脱落。缺氧20h时，与对照组相比，细胞增生降低到79.3％，细胞凋亡指数增加了6.5倍。缺氧24h 前加入75μg/L VEGF使细胞活性增强了1.3倍，凋亡指数下降到2/3。VEGF在10～75μg/L范围内此作用呈剂量依赖性。正常情况下，Flk-1，Flt-1表达很少，但是缺氧后，表达量明显上升，Flt-1更显著。加入SU1498后能部分抑制VEGF对Müller细胞的作用。结论：短时间缺氧使Müller细胞反应性增生，VEGF和Flk-1，Flt-1表达增加，外源性VEGF可能部分地借助于受体Flk-1和Flt-1对缺氧的Müller细胞起到保护作用。
【关键词】 血管内皮生长因子 Müller细胞 血管内皮生长因子受体1 血管内皮生长因子受体2 缺氧 保护
Effects of exogenous vascular endothelial growth factor on rat Müller cells under hypoxia in vitro
Abstract AIM: To observe the effects of exogenous vascular endothelial growth factor (VEGF) on primary cultured rat Müller cells under hypoxia in vitro. METHODS: The rat Müller cells were purified by digestion of the trypsin solution, cultured and identified by cellular morphology and glial fibrillary acidic protein (GFAP). The cell viability was detected by trypan blue staining. The cells were treated with VEGF at different concentrations (10-100μg/L) as well as with VEGF receptor (Flk-1) inhibitor SU1498. The cells were then exposed to hypoxia for up to 24 hours. Light microscopy, MTT assay, TUNEL labeling and SABC immuno-histochemistry were used to measure the changes of cell morphology, growth, apoptosis, and the expressions of VEGF, Flk-1 and Flt-1. RESULTS: The Müller cells were purified from mixed cells (purity>90%, viability>87.3% in Passage 3) and passaged serially. After hypoxia for 8-12 hours, the proliferation and viability of the cells increased progressively, and the expression of GFAP, VEGF, Flk-1 and Flt-1 also increased. But the increased cells showed swelling and suspended in the culture medium. After hypoxia for 20 hours, the proliferation rate decreased to 79.3% and apoptosis index increased 6.5 fold as that of controls. When the concentration of VEGF in cell culture medium reached 75μg/L, the cell viability increased 1.3 fold and the apoptosis index reduces to two third as that of controls. This effect of VEGF on the cells appeared dose dependent (10-75μg/L VEGF). In normal conditions, Flk-1 and Flt-1 expressed at a low level, while after hypoxia, their expressions were significantly increased. The protective effect of VEGF was inhibited in part by SU1498. CONCLUSION: Hypoxia could induce reactive activity of the Müller cells and the expressions of GFAP, VEGF, Flk-1 and Flt-1. The exogenous VEGF may exert neuroprotective effects partially on the Müller cells via VEGF receptor-Flk-1 and Flt-1 in vitro.
· KEYWORDS: vascular endothelial growth factor; Müller cells; Flk-1; Flt-1; hypoxia; neuroprotection
0引言
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），又称血管通透因子，是目前发现的一种强有力的血管生成和血管渗透促进因子。它选择性作用于血管内皮细胞膜上的2种Ⅲ型酪氨酸激酶受体（VEGFR-1/flt-1和VEGFR-2/KDR/flk-1），能高度特异地促进血管内皮细胞有丝分裂和血管形成[1-3]。研究发现，VEGF在血管发生和对神经元保护方面起到重要作用，如在缺血缺氧性脑血管疾病中，VEGF不仅能够诱导血管形成，促进侧支循环[4]，抑制神经细胞凋亡[5]，还能通过VEGF受体对星形胶质细胞发挥保护作用[6]。在缺血性视网膜疾病中，多种视网膜细胞分泌大量的VEGF[1]，而VEGF是促进新生血管生成的主要生长因子，尽管VEGF抑制剂如bevacizumab等已应用于临床，但是仍存在很多问题待进一步研究，如VEGF对Müller细胞的影响。我们研究缺氧条件和外源性VEGF处理后，Müller细胞中VEGF及Flt-1，Flk-1的表达，以期初步揭示缺氧条件下VEGF对Müller细胞的影响。
1材料和方法
1.1材料 健康封闭群二级SD新生大鼠10只，由第四军医大学实验动物中心提供。培养Müller细胞的培养基DMEM和MTT试剂分别购自Gibco和Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司，GFAP抗体、VEGF受体Flk-1、Flt-1的抗体和VEGF抗体购自博士德公司；VEGF购自北京中杉公司；SABC试剂盒购自博士德公司，原位细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司，其它化学试剂均为国产分析纯试剂。 依据改良的视网膜Müller细胞制备方法[7-10]。眼球取自出生1wk内SD大鼠，显微镜下无菌操作取出大鼠视网膜组织，PBS冲洗，于2.5g/L胰蛋白酶中37℃消化15min，过双层的53μm尼龙筛网，400g离心10min，用含有100mL/L胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM中和，400g离心10min。加入100mL/L FBS的DMEM 1.5mL吹打细胞，悬浮接种于培养皿中，加入含有200mL/L FBS的DMEM培养液，培养于37℃，50mL/L CO2，950mL/L 空气，3d换液，待细胞融合，加入含1g/L胰蛋白酶，待细胞收缩，部分细胞悬浮后，将其吸出弃掉，加入含200mL/L FBS的DMEM培养液继续培养。如此2～3遍，细胞形态基本一致后，按1∶2比例进行传代，传3～4代后行免疫组织化学技术鉴定细胞：一抗为兔抗大鼠胶质源纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP），二抗是FITC标记的抗兔IgG抗体，荧光显微镜观察。细胞纯度分析：单位视野内GFAP表达阳性的细胞占总细胞的比例。细胞活力分析：台盼兰染色，活细胞率＝拒染细胞数/（拒染细胞数＋染色细胞数）×100％。
1.2方法 缺氧模型的制作参照[11]，将氯化钴（CoCl2, Sigma产品）用去离子水溶解，配成200μmol/L的溶液，经过滤除菌后-4℃备用。将经纯化鉴定传至3~5代融合前的Müller细胞接种于培养板中，培养24h后再置于缺氧条件下培养24h，或缺氧前加不同浓度的VEGF继续培养24h，实验结束后取出培养板，根据检测指标不同进行处理。盖玻片经PBS洗后多聚甲醛固定，置于-20℃冰箱备用。细胞随机分组：(1)空白对照组：培养的Müller细胞不做任何处理；(2)缺氧组：加入CoCl2 200μmol/L，以建立Müller细胞化学缺氧模型。根据缺氧时间（0，4，8，12，16， 20，24 h）观察缺氧对细胞的影响；(3)VEGF组：分别在正常氧环境和缺氧24h之前加入10，25，50，75和100μg/L VEGF，继续培养24h 后观察对缺氧的Müller细胞的影响；(4)SU1498组：缺氧前24h时加入75μg/L VEGF的同时加入700μg/L SU1498，观察SU1498的影响。不同时间结束实验后，2.5g/L胰酶消化，收集细胞，血球计数板计细胞总数。调整细胞密度为105/L，接种于96孔板，每孔100μL，24h后分别加入10，25，50，75和100μg/L VEGF，继续培养24h 后每孔加入5g/L MTT试剂20μL，继续培养4h后弃培养液，加DMSO 100μL，振荡混匀15min，用酶标仪（λ＝480 nm）测定每孔A值（A值与活细胞数成正比），取其平均值，记录结果。
1.2.1免疫细胞化学法 将培养板中各个时间点的盖玻片取出，PBS浸洗，100mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶， 1∶20的血清封闭20min，滴加1∶50稀释的一抗，一抗为VEGF和Flk-1，Flt-1兔抗大鼠多抗，4℃下过夜，PBS振洗，滴加生物素化的二抗， 37℃ 孵育20min，PBS振洗，滴加SABC复合剂，37℃孵育20min，DAB显色，苏木精复染，中性树脂封片。PBS代替一抗作阴性对照。镜下选择10个高倍视野计数阳性Müller细胞（细胞着棕黄色），并经图象分析仪检测各指标染色的积分吸光度。
1.2.2 TUNEL标记法 使用原位细胞凋亡检测试剂盒（罗氏公司），检测方法操作说明。细胞爬片经PBS洗后，3mL/L H2O2甲醇溶液孵育30min，1mL/L TritonX-100通透液冰浴2min，滴加Tunel反应液（1:10的TdT酶溶液和核苷酸混合液），37℃孵育60 min，再滴加碱性磷酸酶转换液50μL，37℃孵育30min后，DAB显色，苏木精复染后封片。阴性对照是以标记液代替Tunel反应混合液；阳性对照用DNA酶Ⅰ（Sigma）。结果判断：每张切片镜下随机选10个视野，每个视野观察100个细胞，计数Tunel阳性细胞数（细胞核呈棕黄色颗粒），并计算凋亡细胞指数（Tunel阳性细胞数／细胞总数）。
统计学处理：实验结果以均数±标准差表示，采用SPSS10软件统计数据，组间差异判断采用单因素方差分析，α=0.05。
2结果
大鼠Müller细胞在接种后24h内即贴壁，酶消化法纯化后剩下的细胞多数为Müller细胞，原代细胞一般14～20d即可长满，按1∶2比例传代，传代后细胞周期缩短至5～7d，经过2次传代后可获纯度相对较高的Müller细胞。细胞形态主要分为2种：一种胞体较大，不规则片状，折光性暗，胞质内原纤维较丰富，胞突的分支少而短；另一种胞体较小，蜘蛛状，折光性强，胞突多而长。Müller细胞进行GFAP抗体染色，显示绿色荧光为阳性表达（图1）。纯化培养至第3代的Müller细胞，经鉴定其纯度为90%，活力是87.3%。
图 1 培养的第三代Müller细胞GFAP（IF×400）
2.1缺氧对Müller细胞的影响 倒置显微镜下，Müller细胞在缺氧条件下随时间延长而呈现不同的形态学变化。缺氧4h时细胞形态无明显改变。缺氧8h时，细胞胞体开始变大，突起变粗（图2A），GFAP染色增强；缺氧12h时，细胞肿胀变形，胞内细胞器变大，可见细胞脱落（图2B）；缺氧16h以上，细胞增生能力明显减弱，细胞凋亡指数明显增加（表1），细胞脱落增多，但大部分细胞仍然存活，缺氧16h内细胞存活率在83%以上(台盼兰测定)。常氧条件下，VEGF，Flk-1和Flt-1表达很少，缺氧24h以内可见VEGF，Flk-1，Flt-1表达明显增加，Flt-1较Flk-1表达量多，阳性细胞的胞浆和突起中可见有粗大的棕黄色颗粒（图3，4）。24h内随缺氧时间延长，VEGF表达持续增加，而Flk-1，Flt-1表达比较平稳，变化不明显（表1）。缺氧16h前，Flk-1，Flt-1表达量持续上升，Flt-1表达量约为Flk-1的2～3倍；缺氧16 h后两者表达量趋向平稳。
图 2 缺氧的Müller细胞（×200） A:8h, B:12h
图 3 缺氧16 h Müller细胞Flt-1表达（SABC×400）
图 4 缺氧20h Müller细胞Flk-1表达（SABC×400）
2.2 VEGF对Müller细胞的影响 细胞在缺氧前24h时加入不同浓度的VEGF后，终浓度为50，75，100μg/L的VEGF对细胞有明显作用，细胞增生，凋亡减少，作用呈剂量依赖性（表2）。细胞凋亡表现为：核固缩、染棕黄色、着色不均匀，典型的呈指环状（图5）。添加75μg/L VEGF 24h后再经不同时间缺氧，细胞数增多，活性增强了1.3倍，凋亡指数下降到2/3(表3)。
图 5 Müller细胞(TUNEL×400)
2.3 VEGF受体阻断剂SU1498对Müller细胞的作用 在缺氧前24h时加入75μg/L VEGF和700μg/L SU1498，缺氧24 h与VEGF组相比，细胞增生活性降低，凋亡指数升高，而与对照组相比，结果也有明显的显著性，说明SU1498部分抑制了VEGF对缺氧Müller细胞的作用（表4）。
3讨论
我们成功分离培养大鼠Müller细胞并建立细胞缺氧损伤模型，观察了缺氧对Müller细胞的影响，以及VEGF对Müller细胞的保护作用，并对其机制进行了初步分析。正常情况下，Müller细胞很少表达GFAP，VEGF及其受体（如Flk-1，Flt-1），短时间缺氧能够使Müller细胞GFAP，VEGF及其受体的表达显著升高，细胞形态变化，甚至发生凋亡，这种影响呈时相依赖性。缺氧12 h时Müller细胞的损伤最明显，细胞肿胀，活性降低，凋亡指数升高。其机制可能有：（1）缺氧使Müller细胞胞外K+浓度升高，导致细胞去极化及提高其代谢率；（2）缺氧导致无氧代谢增加，产生大量乳酸；（3）缺氧导致细胞内花生四烯酸水平升高[12]，引起细胞肿胀；（4）更重要的是，Müller细胞内的Ca2+超负荷，它可对继发的Müller细胞增生提供信号[13]，促进cyclin D1的合成表达，从而诱导细胞增生[14]。我们在缺氧处理前加入终浓度为10～100μg/L的外源性VEGF，与单独缺氧组比较，细胞活性升高，凋亡指数下降，提示外源性VEGF对Müller细胞抗缺氧损伤具有一定的保护作用。75μg/L和100μg/L VEGF处理组间，细胞活性和凋亡指数差异不明显，说明VEGF对Müller细胞的保护作用在一定范围内（<75μg/L）时呈剂量依赖关系，最大效应剂量可能约为75μg/L，超过75μg/L时，细胞活性并未出现更显著提高，这可能是VEGF受体相对饱和所致。脑组织星形胶质细胞研究发现，常氧下加入10～100μg/L VEGF，GFAP表达增加，细胞增生活性升高，并呈剂量依赖性[15]。加入MEK1抑制剂PD98059和PI-3激酶抑制剂wortmannin抑制了VEGF诱导的脑胶质细胞GFAP表达[14]，说明正常环境中VEGF对脑胶质细胞的作用机制包含PI3/AKT和ERK/MAPK两条通路。Müller细胞是视网膜中一种特化的星形胶质细胞，具有一般星形胶质细胞的特点，但VEGF对缺氧Müller细胞作用机制是否也通过这两条通路实现，还需要进一步证实。
血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）是VEGF特异性的膜受体，根据其结构与功能的不同主要分为：Flt-1(fms-like tysosine kinase)，KDR/Flk-1（kinase insert domain containing receptor）及VEGFR-3共3种[16]，Flt-1，Flk-1主要在血管内皮细胞表达，另外，Flk-1还分布在神经细胞、单核细胞和滋养层细胞等处。Khaibullina等[17]认为，Flk-1参与血管形成[18]、神经营养和神经保护过程[19]，而Flt-1明确的作用至今还不清楚，有人认为与胶质细胞有关[20]。Mani等[15]研究证实，用Flk-1和Flt-1的反义寡核苷酸发现VEGF对脑胶质细胞起保护作用的主要受体是Flt-1而非Flk-1，而且在外源性VEGF为25μg/L时，细胞的增生活性即明显增加，VEGF为100μg/L时，细胞增生活性最高，凋亡指数最低。本实验中，加入Flk-1阻断剂SU1498后，VEGF对细胞的缺氧保护作用受到抑制，说明Flk-1参与了此过程，VEGF可能是一种细胞受缺氧应激因素影响下的保护因子。Flk-1，Flt-1随缺氧时间表达量增加，并呈剂量依赖性，以Flt-1最为明显，说明Flk-1，Flt-1都参与了 VEGF对缺氧Müller细胞的作用，以Flt-1更为重要。本实验所得量效关系与上述报道有所不同，可能与细胞种类、处理因素及VEGF的来源不同有关。
总之，Müller细胞是视网膜中重要的神经细胞之一，发挥重要的视觉功能，研究缺氧条件下VEGF对Müller细胞的作用及其机制，可以有助于另一个侧面研究缺氧和辅助VEGF对于视网膜中多种细胞的影响，有助于各种视网膜细胞功能损伤的机制探索，为缺血性视网膜疾病的提供新的思路。
【】
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