活性氧清除剂对实验性视神经炎作用的研究进展
【摘要】 活性氧簇(ROS)是神经系统脱髓鞘及血脑屏障破坏的媒介。ROS包括过氧化物及笑气（NO），由浸润的炎症细胞释放，其代谢产物包括过氧化氢（H2O2）、过（氧化）亚硝酸盐及羟基。在实验性视神经炎的动物模型中，发生了神经系统的脱髓鞘及血脑屏障的破坏，这和炎症细胞释放的ROS增加有密切关系，因此活性氧清除剂在保护炎症中的视神经免受氧化应激损伤方面显得尤为重要。本文针对近年来活性氧清除剂对实验性视神经炎的研究作一综述，从而也从病因上对视神经炎的治疗进行探讨。
【关键词】 活性氧簇 清除剂 视神经炎
Progress of the therapy research of the active oxygen scavenger to experimental optic neuritis
Abstract Reactive oxygen species (ROS) are mediators of demyelination and disruption of the blood-brain barrier (BBB). Reactive oxygen species include superoxide and nitric oxide, released by infiltrating inflammatory cells, and their metabolites hydrogen peroxide (H2O2), peroxynitrite, and hydroxyl radical. Demyelination and disruption of the BBB occurs in nerve system of the experimental optic neuritis, which has great relationship with the release of the ROS by inflammatory cell. Thus the active oxygen scavenger plays an important role in the protection of the optic nerve in the inflammation from the injury of oxidative stress. The following article is a review of the therapy research of the active oxygen scavenger on experimental optic neuritis, thereby trys to find an active therapy of optic neuritis from the pathogenesis.
· KEYWORDS: reactive oxygen species; scavenger; optic neuritis
0引言
视神经炎指视神经任何部位发炎的总称，临床上根据发病部位不同，分为视盘炎及球后视神经炎。局部病灶感染、全身传染性疾病、代谢障碍和中毒、脱髓鞘病是其四大病因。然而，临床上约有半数的病例查不出病因。目前针对视神经炎尚无确切有效的治疗方法，虽然很多报道大剂量甲基强的松龙冲击疗法对于视神经炎有较好疗效，但许多有经验的临床医生仍发现即使采用这种疗法，还是有许多病人预后很差，甚至视力丧失。这是因为对于视神经炎详尽的致病机理不明，目前的治疗并未从病因入手，导致疗效不确切[1]。
1实验性变应性脑脊髓炎动物模型
在建立视神经炎的动物模型中，常采用实验性变应性脑脊髓炎模型（EAE）。因为视神经在EAE及多发性硬化（MS）中常常被侵袭，且在这两种疾病中，和髓鞘成型有关的少突神经胶质是免疫损伤的主要目标。血脑屏障渗透性的改变在EAE诱导的脱髓鞘的病因中扮演了主要角色，同样的，这种改变也发生在免疫介导的疾病视神经炎及MS上[2,3]。血脑屏障的破坏导致炎症细胞及有害因子侵入中枢神经系统引起脱髓鞘作用[4]，表现为微管和神经微丝的水肿变性进而溶解。视神经炎患者活检标本的病理检查发现的炎症反应及脱髓鞘作用也同样在EAE病人的视神经上被发现，EAE动物的视觉诱发电位同视神经炎及MS的患者一样显示潜伏期增长。核磁共振成像显示造影增强及脱髓鞘改变在患者及EAE的视神经上表现相似。正因为与人类视神经炎如此相似，EAE才成为我们理想的模型用于证明我们的猜想，即增强细胞对于炎症应答产生的自由基的防御能力能保护视神经抵抗脱髓鞘及血脑屏障的破坏。
2活性氧簇（ROS）对神经系统的破坏作用
ROS包括过氧化物及笑气（NO），由浸润的炎症细胞释放，其代谢产物包括过氧化氢（H2O2）、过（氧化）亚硝酸盐及羟基。ROS是神经系统脱髓鞘及血脑屏障破坏的媒介。为探索急性实验性变应性脑脊髓模型中，ROS与血脑屏障渗透性改变之间的关系，曾对此模型的视神经上的H2O2进行定位。结果发现在视乳头，高密度的铈—过氧化氢反应产物和血管内的粒细胞一同出现，在有髓鞘的球后视神经，铈—过氧化氢反应产物出现在血管腔内并围绕着血管外及间质聚集的炎症细胞，反应产物还出现在视乳头及球后视神经的邻近轴索质膜及神经胶质细胞的细胞外间隙。这种铈—过氧化氢反应产物血管周围及血管内的分布揭示H2O2可能在改变EAE血管渗透性的发病机理上扮演了重要的角色[5]。对EAE豚鼠有髓鞘的球后视神经、无髓鞘的视乳头及视神经鞘上的铈—过氧化氢反应产物进行一系列的定量分析，结果发现在抗原致敏后的第3d，铈—过氧化氢反应产物颗粒在有髓鞘的球后视神经上达到最大量，但是在抗原致敏7～14d后减少。在抗原致敏后的第3～14d，反应产物在无髓鞘的视乳头及视神经鞘上聚集。前者说明在有髓鞘的球后视神经，H2O2因对髓鞘的过氧化作用消耗掉，从而导致抗原致敏后7～14d的脱髓鞘过程。后者说明过氧化氢反应产物在无髓鞘的视乳头及视神经鞘上聚集就像对H2O2向球后视神经及周围神经弥散提供了一个容器，造成了在EAE及MS中视神经的频繁受侵[6]。而对EAE豚鼠视乳头及球后视神经的铈—过氧化氢反应产物和血管周围外渗的免疫金标记的血清白蛋白进行共同定位发现，在血管周围及邻近的细胞间隙，免疫金标记的血清白蛋白常常和铈—过氧化氢反应产物同时出现，而在血管周围没有铈—过氧化氢反应产物及炎症细胞聚集的地方，免疫金标记的血清白蛋白常常出现在血管腔内。免疫金标记的血清白蛋白常常和铈—过氧化氢反应产物同时出现的血管占61.8%，而两者没有同时出现的血管占9.5%，此结果在统计学上有显著差异，进一步说明在实验性视神经炎中，在破坏的血脑屏障病灶处发现的H2O2，可能是改变血管渗透性的一个致病因素[7]。另有报道活性氧笑气（NO）在神经系统炎症性脱髓鞘疾病中因为会引起轴索变性，所以成为影响神经冲动传导的重要因素[8,9]。
3活性氧清除剂对神经系统的保护作用
活性氧清除剂包括过氧化氢酶（catalase）及过氧化物歧化酶，后者歧化过氧化物生成过氧化氢，而catalase能将过氧化氢分解成无毒的水及分子氧[10]。有报道细胞外catalase及过氧化物歧化酶的基因转染改善了大鼠的由抗原诱导的关节炎[11]。catalase存在于几乎所有需氧细胞的过氧化物酶体中，因此对很多细胞都有保护功能[12]。catalase的过度表达保护了纹状体神经元免受大脑局部的短暂性缺血损害[13]，保护了角膜内皮细胞因过氧化氢导致的氧化损伤[14]，也保护了体外培养的海马及皮质神经元的坏死[15]。而过氧化物歧化酶在转基因动物中的过度表达对局部缺血、神经兴奋性中毒等引起的神经损伤具有保护作用[16]。在EAE中，内源性的活性氧清除剂不足以保护中枢神经系统免受ROS诱导的损伤。外源性给予活性氧清除剂能减少实验性视神经炎中血脑屏障的破坏及神经系统的脱髓鞘作用[17]。
3.1过氧化氢酶 为研究在实验性视神经炎中catalase对于内源性H2O2的解毒作用，将致敏后的豚鼠分为对照组和实验组，实验组从致敏后的第3d开始每日腹腔内注射聚乙二醇—过氧化氢酶（PEG—catalase）,剂量为12 000U/kg，持续3d，而后改为1 200U/kg，持续1wk。而对照组注射相同容积的生理盐水。结果发现，在抗原致敏后7，10，14d分别用对比增强核磁共振测得的兴趣部位（ROI）的一种造影增强剂钆-DTPA (Gd-DTPA)增强值显示，实验组明显低于对照组，而T2加权相的信号强度显示，只有7， 14d的值实验组明显低于对照组。同时，铈—过氧化氢反应产物的定量测定揭示，在视乳头、视神经鞘及球后视神经上的铈颗粒计数实验组明显低于对照组。由此得出结论：PEG—catalase减少了视神经上的过氧化氢反应产物但并不能消除它，而实验组与对照组Gd-DTPA增强值的显著性差异提示PEG—catalase降低了H2O2对血脑屏障的破坏程度，T2加权相的信号强度的显著差异提示PEG—catalase减少了视神经的水肿及脱髓鞘作用[17]。此研究为将H2O2的解毒作为治疗中枢神经系统原发性脱髓鞘的一种新方法提供了实验依据。
但是上述实验有其局限性，因为catalase是一种大分子蛋白质，即使和聚乙二醇（PEG）结合后，为延长其半衰期，仍需要每日注射[17]，而在治疗过程中随着血脑屏障完整性的恢复，限制了其后注射的高分子量的catalase进入神经系统，视神经炎的复发部分原因就是因为catalase蛋白无法通过逐渐恢复完整性的血脑屏障，从而影响了其治疗效果。因此，必须找到一种新方法，让活性氧清除剂的作用能够得到充分发挥。Catalase基因编码的转染帮助我们解决了这个难题。病毒介导的基因传递为这种治疗性基因的转染带来了希望。将含有catalase人类基因的腺病毒重组体注射入刚被致敏的SJL/J小鼠的右侧视乳头，不含有catalase人类基因的腺病毒重组体注射入对侧视乳头作为对照。1mo后，用catalase免疫金标记法，对细胞特异性catalase活性进行定量评估发现，在实验组视神经的内皮组织、少突神经胶质、星形胶质细胞及轴突上，catalase活性增加了大约2倍。而catalase对组织损伤的疗效则通过以下几个指标来评价：髓鞘(了解脱髓鞘情况)、视乳头（了解其水肿情况）、微孔渗透程度，通过外伸的免疫金标记的血清白蛋白观察（了解血脑屏障的破坏情况）、H2O2反应产物的定量分析。结果发现，与对照组相比，catalase基因免疫接种减少了38%的脱髓鞘作用，29%的视乳头水肿，34%的微孔渗透，使血脑屏障破坏降低了64%，使H2O2水平下降了61%。所以，此实验证实以病毒作为载体的catalase基因转染至少对于EAESJL/J小鼠的视神经炎具有确切的治疗作用，从而推测这也许能成为治疗MS及常常与之共同发生的视神经炎的一种有效方法[18]。因为用腺病毒重组体接种后蛋白质表达的转导相对较慢，需要数周才能达到最高水平，故用含catalase人类基因的有复制缺陷的腺病毒再次实验，发现其蛋白质表达的转导在接种数日后即发生，1mo后，与对照组相比，catalase基因免疫接种减少了30%的脱髓鞘作用，25%的视乳头水肿，26%的微孔渗透，使血脑屏障破坏降低了61%，使H2O2水平下降了81%。在实验组视神经的内皮组织、少突神经胶质、星形胶质细胞及轴突上，catalase活性增加了大约2倍，从而推测对于急性视神经炎的患者，利用这种病毒作为基因转染的载体进行治疗也许更适用[19]。
3.2过氧化物歧化酶 目前在研究活性氧清除剂对实验性视神经炎的中，对catalase研究得较多，而对另一种活性氧清除剂过氧化物歧化酶的研究相对较少。大概是因为其作用是歧化过氧化物生成H2O2, H2O2仍然是一种活性氧，因此并未从根本上起到解毒作用，所以过氧化物歧化酶疗效可能不如catalase确切。尽管如此，为研究锰-过氧化物歧化酶（Mn-SOD）及铜/锌-过氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）对EAE中视神经的保护作用。Qi等[20]对EAE豚鼠及正常豚鼠视神经上的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD及过氧化氢反应产物进行对照观察发现，在EAE豚鼠的视神经切片上，光镜下显示Mn-SOD阳性细胞分布在血管周围，电镜下显示只有Mn-SOD免疫金标记颗粒出现在视神经细胞的线粒体中，而Cu/Zn-SOD免疫金标记颗粒在EAE豚鼠及正常豚鼠视神经细胞的胞质及细胞核中都有分布。相对于正常豚鼠，在EAE豚鼠的视神经切片上，小胶质细胞/吞噬细胞中免疫金标记颗粒在星形胶质细胞中升高8倍，在小胶质细胞/吞噬细胞中升高13倍。增加的小胶质细胞/吞噬细胞中免疫金标记颗粒出现在过氧化氢反应产物附近，而没发现EAE豚鼠的视神经中有Cu/Zn-SOD免疫金标记颗粒的增加。此结果说明，在星形胶质细胞及小胶质细胞/吞噬细胞中Mn-SOD的增加在一定程度上保护了这些细胞免受氧化损伤，而在少突胶质细胞及轴突中Mn-SOD的低水平表达增加了它们对氧化损伤的易感性从而导致脱髓鞘作用。此后，Qi等[21]用腺病毒介导的核酶降低小鼠线粒体中的SOD2mRNA , 使其编码的Mn-SOD表达降低，ROS的水平上升，最终导致视神经变性。此实验进一步证实了超氧化物歧化酶在视神经保护中的作用。
4结语
目前活性氧清除剂对于实验性视神经炎的疗效已得到肯定。实验性变应性脑脊髓炎动物模型的建立为我们对于视神经炎发病学及治疗学的研究提供了可行性。但是因为现在的研究还只局限于动物模型，缺少临床实验依据，活性氧清除剂临床应用及其具体的给药时机、方式、剂量及药物疗效等还需进一步研究。
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