青光眼基因治疗研究进展
【摘要】 最近研究表明，青光眼患者眼压升高及视网膜节细胞损伤和死亡可能与某些相关基因的结构及功能异常有关，因此，基因作为一种新的治疗方法已逐渐在医学领域中应用, 为青光眼的防治提供了广阔的前景。本文对目前进行的基因治疗研究进行综述。
【关键词】 青光眼 基因治疗
Advances in gene therapy for glaucoma
Abstract Previous studies in molecular genetics have indicated in glaucoma elevated intraocular pressure and damage of death of retinal ganglion cells may be related to the abnormality of related gene. So gene therapy has been gradually applied in medical domain as a kind of new treatment method, it provides extensive prospect for the prevention and cure of glaucoma. This paper reviews advances in gene therapy for glaucoma.
· KEYWORDS: glaucoma; gene therapy
0引言
青光眼是一组以进行性视神经损害和神经元丧失为特征的眼部疾患。青光眼作为全世界第二位的致盲眼病,其有效防治越来越成为防盲治盲和公共卫生工作的重点。眼压升高和缺血是引起青光眼性视网膜神经节细胞 (retinal ganglion cells， RGCs)丧失的两个刺激因素，高眼压将直接损害视神经轴突，并导致RGC不可逆性丧失。由于RGC死亡的确切分子机制还不是很清楚，目前还没有有效的治疗来预防严重青光眼患者的视功能丧失[1]。目前青光眼的治疗仍以降低眼压为主,但常用的药物存在较严重的并发症。而手术治疗如滤过性手术,效果不是很理想，一方面很多患者术后因发生滤过泡疤痕化而影响眼压控制，另一方面一些患者即使眼压已经控制达正常范围,他们的视功能损害仍继续进展,且无有效的治疗方法。
基因治疗是用基因工程技术,对基因进行改建、修饰和置换,或对异常基因表达进行干预以治疗疾病的方法。其含义是从导入基因纠正遗传病的基因缺陷,扩大到导入外源基因达到治疗效果的所有治疗方法。转基因技术适合治疗青光眼，在于青光眼的慢性过程和比较明确的病基础[2] 。解剖学、遗传学和基因表达图谱已经证明转基因技术治疗青光眼，包括改善房水引流、减少滤过泡疤痕形成和保护RGC已成为可能。本文对青光眼基因治疗研究现状进行综述。
1转基因治疗青光眼的靶组织
青光眼基因疗法特有的靶组织结构或细胞类型包括小梁网(trabecular meshwork, TM)、睫状上皮(ciliary epithelium, CE)、睫状肌(ciliary muscle, CM)、视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)和Müller细胞(MCs)。小梁网位于前房角，是一种由不同内皮细胞和细胞基质以特定结构形成的海绵状组织；它负责维持房水流出的阻力和保持眼球的形状。睫状上皮包括两种紧密连接的覆盖在睫状突的细胞层，外层细胞面向后房，是非色素性上皮，主要分泌房水。房水产生后，进入前房，通过小梁细胞和内层Schlemm管壁离开眼球而进入静脉系统。睫状肌紧邻睫状上皮和小梁网。一旦睫状肌收缩，晶状体调节力增加，小梁网的构型发生变化，房水流出易度增加。RGCs，视网膜的最内层细胞，通过其轴突将光信号传导至大脑，其轴突组成了视神经。许多刺激伤害，通常是眼压升高引起RGCs损害和凋亡，最后导致视神经纤维丧失[3]。
2青光眼基因治疗的有关载体
能将遗传物质传送入视网膜或RGC的载体系统至少应具备以下四种生物学特性：(1) 能对准目标的特有细胞类型，其目标或者是受染细胞，或者是邻近细胞，例如，引入分泌性治疗药物的基因。(2) 基因传导应该有效，即现有的载体滴度和有限的剂量可以很安全地注射入各种视网膜间隙，传代基因能有效地复制，并进入足够多的靶细胞，允许治疗药物在视网膜特定部位进行表达。(3) 载体相关表达应该恒定并适当地持续较长时间。(4) 载体本身毒性应该很低，这包括药理学毒性、针对传导基因产物、输入载体或者源于输入载体的任何表达基因的局部和全身免疫反应。
目前用于青光眼转基因治疗，并满足这些生物学特性的载体可分为病毒和非病毒两种方法：
2.1病毒方法 病毒方法是利用载有目的基因的复制缺陷病毒感染靶细胞。
2.1.1相关的DNA病毒载体 ⑴ 腺病毒(adenovirus，Ad) 载体：最初的腺病毒载体能够搭载大约8kb的传代DNA。几种早期的病毒基因的附加失活作用产生的复制缺陷病毒载体能够在传导的视网膜细胞中生长并形成很高的滴度。基因表达通常在接种后24h内出现，这使得在动物模型中进行研究变得非常方便。重组的腺病毒由于宿主对输入的病毒颗粒本身和因为感染而产生的大量病毒蛋白质的反应，故具有相对的免疫原性。然而，眼部的相对免疫特性使得暂时性的腺病毒相关的基因治疗仍然有效。由于重组的腺病毒DNA并不能稳定地整合入宿主染色体的DNA中，所以其在眼组织中传达的基因表达是暂时性的，一般保存1～3mo。如果其引起的免疫反应能进一步减轻的话，特殊的短期基因治疗干预，将是有利时机[4]。⑵ 腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV) 载体：通常这种病毒感染人类，并不引起已知的疾病。它是一种小的单链DNA病毒，它本身只产生非常小的蛋白质，因此具有相对的非免疫原性。如果没有与野生型辅助病毒(通常是人类腺病毒) 一同感染，野生型AAV能稳定地整合入人类19号染色体的特定位点，并建立隐匿性感染。相反，由于在重组的AAV(rAAV)中删除了这种特殊整合位点所必需的病毒rep蛋白质，目前的AAV载体并不具备这种特性。然而，体内实验显示，rAAV能在长达数周或数月内缓慢地整合入随机的染色体位点，这取决于靶细胞，也使得长期性的、或者是永久性的传导成为可能。与重组的腺病毒不一样，rAAV似乎能传导正常的RGC和光感受器细胞与视网膜色素上皮细胞。但是，当前的rAAV具有两大缺陷：① 它限定了搭载的DNA不能超过4.8kb。尽管AAV适合于目前的可用于视神经保护治疗的绝大部分基因，但是，只有有限的空间用于调节成分，这是为精确地协调和控制基因表达所必需的，才能起作用。②如果rAAV整合确实是随机的话，理论上就存在插入的基因突变。这使得临床前期研究比其他载体更加费时，而且不可能很快用于视网膜变性疾病的动物模型中。目前一种新的，更加有效的rAAV包装技术能很好地避免低病毒滴度和野生型腺病毒辅助剂的低水平污染引起的一些早期问题[5]。⑶单疱病毒(herpes simple virus, HSV)载体：HSV能有效地将有益基因转入青光眼相关的结构和细胞。在猴和啮齿类，通过前房注射，在TM和CE转染效率很高，而其他细胞如虹膜色素上皮细胞和角膜内皮细胞转染效率较低。只有在CMV启动子和HSV载体一起进行实验时，基因表达最多持续10d[6,7]。HSV在RGCs亦能产生有效的转染，但在灵长类，其传导位置只局限于传送部位[3]。
2.1.2逆转录病毒(RV) 载体 其优点是目的基因可以整合到染色体上,可以实现稳定长期表达,而且转移效率高。但目前应用于基因疗法的大部分RNA病毒载体都是源于鼠类白血病逆转录病毒。它不能转染非增殖期的细胞,所以不适用于角膜内皮及视网膜等组织的基因转染。相反，基于人类免疫缺陷病毒(human immuno-deficiency viruses，HIV)和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency viruses，SIV)的慢病毒载体(lentiviral vectors) ，编码诸如vpr之类的蛋白质，允许细胞核输入病毒基因组，而不影响相伴随的有丝分裂。慢病毒载体(lentiviral vectors) ：这种载体通常是假表型的，即为包被另外一种病毒蛋白质作准备。能够以这种方式搭载慢病毒，并具有这种特性的细胞通常是CD4+ T细胞，允许慢病毒感染多种细胞。慢病毒含有泡状口腔炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV-G) 的糖蛋白，已经成功地用于鼠类视网膜。在一次接种后能感染整个视网膜，并能至少稳定3mo。它需要将染色体整合，才能获得基因表达，这提示病毒载体能在RGC进行长时期传导。但是这种载体具有以下几种技术缺陷：① 任何基于人类的免疫缺陷病毒的载体系统在可以用于人类之前，都必须证明不会产生野生型人类免疫缺陷病毒。许多新近的基于病毒载体已经删除了原来的人类免疫缺陷病毒基因组的重要节段，因此，进一步减少了产生感染性病毒的危险性。②按照目前的滴度，需要30～100μL 重组病毒才能达到整个人类视网膜。最近，病毒颗粒的稳定性和浓缩技术已得到明显改善，因此，容量问题将会被解决。③需要关心的是基于人类免疫缺陷病毒载体的整合问题。整合位点似乎是随机的，因此，可能存在整合所导致的基因突变。很可能需要更精细和更大的启动子以平衡转基因和内源性基因的长期表达。染色质结构已被认为是基因表达的重要调节子，并强化了近端启动子不仅仅只是一个重要想法的思想。病毒载体整合入基因组的位点往往影响治疗性基因的表达，所以，下一代的启动子应该含有开放性染色质的调节子，诸如位点控制元素，它可以在一些情况下以暂时性的方式上调或下调治疗性基因产物水平。继续研究视网膜细胞特殊的启动子，已被认为是基因疗法的必要进展[8]。Lotery等 [9] 通过玻璃体切割和视网膜下注射将重组的猫免疫缺陷病毒(recombinant feline immuno-deficiency virus, rFIV) 载体将β半乳糖酶基因转染入cynomolgus猴视网膜。结果表明光感受器和Müller细胞有极好的转基因表达。局部炎症反应只局限在注射部位。电生理检查表明，视功能不因载体注射而受到明显影响。这提示视网膜下应用rFIV载体能转导非灵长类视网膜各种类型的视网膜细胞，rFIV载体具有潜在的治疗作用，并可用于人眼的基因疗法。Loewen等 [10]采用视网膜下注射2μL的猫免疫缺陷病毒(feline immuno-deficiency virus, FIV) 或腺病毒载体，比较两种载体行视网膜转基因的长期表达情况，在剂量-反应研究中，2×105传导单位(transducing units, TU) 中，两种载体在视网膜的传导范围一致；但在长期表达研究中，在不同的时间点(1wk；1，3，6，12和16mo)FIV载体的表达程度(grade) 均比腺病毒载体高。但大部分腺病毒注射眼均出现了局部巨噬细胞样细胞的聚集和视网膜结构的破坏。结果表明，慢病毒载体经随访16mo仍能持久表达，可用于慢性视网膜疾病的基因治疗。
2.2 非病毒方法 包括脂质体介导法和受体介导法等。与病毒方法相比,没有致癌性,也排除了病毒感染,缺点是整合率低。近年来,人们对脂质体介导的转移方法有了较多的研究,转导效率有很大提高,如脂质体转染试剂Lipofectin 及其新一代产品Lipofectimine 。Hangai 等[11，12]用其特殊的脂质体转染系统对视网膜感光细胞层取得了较好的转染效果,但基因表达时间较用AV 载体明显短,注射后30d时基因表达已经十分微弱或消失。由于脂质体介导法还具有安全、方便的优点,所以是一种很有前途的目的基因运载体系。Hart 等[13]用受体介导法转染视网膜组织也取得了较好效果。
3青光眼的基因治疗效果
尽管大多数青光眼的遗传基因尚不清楚，但编码眼压降低和/或视神经保护基因的转染和表达可改变相关细胞的生理状态和阻止发病。与其他慢性疾病一样，应用基因治疗青光眼将提供长期有效的治疗效果。
3.1改善房水循环 目前可用于处理眼前节组织降低眼压的药物必须每天用药，那么顺从性是个主要问题。基因疗法可以减轻这个问题。
3.1.1减少房水的生成 房水的生成主要靠睫状突非色素上皮逆浓度梯度,将Na + 泵入后房。睫状突非色素上皮细胞紧密连接,形成血－房水屏障,在Na + / K+ATP 酶的作用下,Na + 由细胞主动分泌入后房,这是一个耗能过程,且与HCO3- 和Cl - 协同转运。而通过α2，β2肾上腺素能受体可调节腺苷酸环化酶的活性,继而影响Na + / K+ATP酶的活性[14]。目前许多药物都有抑制与房水生成相关的酶或离子泵的作用,如Na + / K+ATP 酶对乌巴因(ouabain) 敏感,可被其抑制而减少房水的生成;目前应用较多的β2受体阻滞剂,其作用机制就是抑制睫状体上皮的离子泵或酶的活性,引起第二信使的改变从而抑制房水的生成。以上研究结果提示,可以通过影响与房水生成相关的几个步骤减少房水的生成。根据房水的生成原理,目前至少可由以下几个途径通过基因敲除的方法减少房水的生成：⑴基因敲除与房水生成相关的酶或相关的离子通道；⑵基因敲除腺苷酸环化酶减少房水的生成；⑶ 基因敲除G蛋白,减少房水的生成。
3.1.2疏通房水流出通道增加房水的排出 将外源基因导入小梁网以治疗青光眼， Borras 等[ 15]将外源基因导入小梁网细胞中,基因可表达7d。Budenz 等[16]将含有lacZ 基因的腺病毒载体注入前房和玻璃体内,结果发现小梁网细胞可表达持续14d。使用灌注眼培养系统,Borras 等[ 17] 将管蛋白( tubulin) 基因导入小梁网细胞中,可降低眼压。
3.2视神经及视网膜神经节细胞的保护性治疗[18] 青光眼性RGCS凋亡的激发因素主要有神经营养因子的剥夺和兴奋性毒素一氧化氮的毒性作用。高眼压或低血流灌注压导致缺血缺氧等，使RGC轴浆流中断，靶源性神经营养因子供应中断，同时兴奋性毒素大量产生，激活诱导凋亡的基因作用于细胞表面受体，启动RGC凋亡程序。已有研究表明重复眼内注射神经营养因子能暂时性拯救因轴突损伤导致的RGC死亡。采用基因疗法转染这些营养因子，能克服重复注射带来的并发症。
脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 是一种重要的RGC存活因子。Di Polo等[19]通过玻璃体腔内BDNF表达的腺病毒载体能暂时性延缓视神经横断性损伤后RGC死亡。但是基于腺病毒载体的转基因表达有效时间相对较短，而且其本身易引起炎症反应。腺相关病毒(AAV) 载体能够在视网膜进行长期的转基因表达，引起的眼部炎症反应很轻微。Martin等[20]通过采用532nm二极管激光处理大鼠小梁网引起中等程度的慢性眼压升高，只导致特异性的RGC丧失，而不损害其他视网膜层。他们采用独创的AAV-BDNF结合土拨鼠肝炎逆转录调节元素(woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element, WPRE),单次玻璃体腔内病毒注射2wk内就很容易在大鼠RGC层神经元产生很高的转染效率。结果表明实验性青光眼4wk后，玻璃体腔内注射AAV-BDNF-WPRE与单纯注射生理盐水或不含BDNF的对照病毒相比，能明显增加RGC的存活率(轴突计数) ，进一步支持神经营养疗法可作为青光眼降低眼压的补充治疗的潜在可行性。
Dingwell[21]等证实碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) 在RGC生长发育过程中是一种潜在的刺激因子。但Cui[22]在视神经颅内段轴性损伤后，采用眼内注射bFGF蛋白质未能显示RGC再生。据推测，这是由于bFGF在体内的半衰期很短，在眼内持续时间有限。Sapieha等[23]采用视神经微压榨伤(micro-crush lesion) 制作视神经损伤模型，用重组AAV将bFGF基因转入成年SD大鼠玻璃体腔，以利于bFGF的持久释放。与对照组的神经相比，FGF-2基因转染后，视神经轴突从病变部位向后的数量要多10倍，这种上调反应与FGF受体-1表达相关。bFGF转基因表达只对受损的RGC起暂时性的保护作用，而且这种神经营养因子对轴突延伸并不能代表神经元存活数量的增加。
近年来，睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNDF) 被证明是能改善受损的RGC的存活与再生最有前途的神经营养因子之一。Van Adel等[24] 采用视神经横断性损伤作为在体模型，评价具有自我失活的复制缺陷的慢病毒相关的载体转染人类睫状神经营养因子(SIN-PGK-CNFT) 对成年大鼠RGC轴突存活率的影响。他们采用单次玻璃体内注射慢病毒编码的人CNTF(LV-CNTF) 基因或细菌β-半乳糖酶(LV-LacZ) 作为对照组，在大鼠视神经轴性损伤后14d与21d检测RGC的存活情况。结果表明，与对照组相比，用lentiviral作为载体应用CNTF，能明显增强RGC的存活，而且效果比单纯玻璃体内注射重组人CNTF要好。
色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF) ，是一种50kDa蛋白质，由人胚胎视网膜色素上皮细胞分泌。已经证明PEDF是一种有希望的内源性新生血管形成抑制剂和神经保护蛋白质。Takita等[25]采用前房内灌注生理盐水，将大鼠眼压升高至110mmHg，持续60min，制作压力诱导的视网膜缺血-再灌注模型。在模型制作前4d玻璃体腔内注射腺病毒载体表达的PEDF (AdPEDF.11) 颗粒。结果表明，节细胞层细胞密度明显多于对照组(AdNull.11) ；但凋亡细胞数(TUNEL阳性细胞) 明显少于对照组。提示腺病毒载体相关的眼内PEDF表达能明显增加视网膜缺血-再灌注(急性高眼压) 损伤神经元的存活率，这种保护作用可能源于抑制缺血诱导的凋亡，并认为转基因方法能直接干扰因视网膜缺血所导致的细胞程序化死亡。
原癌基因bcl-2的过度表达可以减少细胞凋亡，但它是否影响轴突再生尚无定论 。bcl-2在胚胎感觉神经元的体外实验以及生后受损RGC的体内、外实验中可以促进轴突生长，但却不能诱导新生小鼠轴突重建。在成年啮齿类动物，即使去除了髓鞘相关抑制分子或加入周围神经移植物，bcl-2过度表达仍不能进一步加强轴突再生。Bcl-XL是bcl-2家族的一个成员，去除该基因可增加发育性细胞死亡，而过度表达可保护生后及成年神经元免于创伤、缺氧、代谢等损伤[26]。Kretz等[26]将Bcl-XL通过腺病毒载体在体外、体内受损的RGC中过度表达后，发现能使培养的RGC轴突的数目、总长度增加，活体视网膜内RGC的轴突可以长入邻近的视神经断端，但不能通过瘢痕形成的区域。其中机制有待阐明，Bcl-2和Bcl-XL很可能是通过调节细胞存活和再生的通路而起作用的。
3.3抑制滤过泡的瘢痕化[27,28] 眼压升高是青光眼的主要危险因素，施行手术降低眼压仍然是青光眼的主要手段。滤过性手术是目前常用的抗青光眼手术，但术后滤过道的疤痕形成将导致手术失败，因此常常在术中或术后联合应用抗代谢药物，如丝裂霉素C(mitomycin, MMC)和5-氟尿嘧啶以减少滤过道的疤痕形成。但它们同时也会产生意想不到的副作用，如低眼压和由于细胞破坏导致的组织变性。基因疗法能预防青光眼滤过性手术后增殖的伤口愈合反应。Perkins等[29]给新西兰白兔施行全层巩膜切除术，并在以角膜缘为基底的结膜瓣下放置浸有含人p21基因(rAd.p21) 的复制缺陷的重组腺病毒、非特异的绿荧光蛋白标记基因(green fluorescent protein，GFP) 、β-半乳糖酶(beta-galactosidase) 、MMC(0.5g/L) 及平衡盐溶液的纤维素海绵5min。结果表明，经rAD.p21基因处理的筋膜成纤维细胞DNA合成和细胞生长呈现剂量依赖性抑制。但MMC引起薄壁滤过泡、前房积脓等并发症，在rAD.p21基因处理组未发现。两组在实验结束时均可见功能性滤过泡。这提示rAD.p21基因疗法能为青光眼滤过性手术提供有效的抗纤维增殖作用，但没有MMC相关的并发症发生。为进一步了解rAD.p21基因的适应证，Wen等[30]研究了兔眼结膜局部转染腺病毒p21基因后，载体传送、靶组织的转基因表达、炎症反应、非靶组织的生物分布和免疫反应等特征。结果表明，结膜下注射rAd.p21后，其生物分布只局限于眼组织；滤过性手术后，将rAd.p21转染至结膜下，术后早期引起急性炎症反应，但到第14天时与安慰剂对照组无明显区别。这些结果显示，将基因局部转染至结膜是一个非常合适的眼部基因转染模型。
Heatley等[31]先采用重组腺病毒将人类p21(WAF-1/ cip-1 )基因引入猴高眼压眼，然后施行小梁切除术，结果表明经p21处理眼造瘘口在功能上、组织学上均保持开放，并没有发现在对照眼上出现丝裂霉素C治疗的副作用。Yoon等[32]在正常兔眼施行青光眼滤过性手术后，结膜下注射2μg human RAD50 (hRAD50 )基因，采用光镜和电镜比较hRAD50处理组与MMC处理组和正常对照组的形态学改变。结果表明，局部应用RAD50 的抗纤维增殖作用与MMC相同，但没有结膜上皮基质层的损害，提示hRAD50可作为一种可能的抗纤维增殖药物用于青光眼滤过性手术，但需要更进一步研究其可能存在的全身并发症。
4与青光眼组织相关的潜在的靶基因
4.1小梁网 ①细胞骨架调节蛋白：通过破坏细胞骨架结构，刺激房水流出增加；②Myocilin基因：高度表达野生型位点，竞争突变位点；③金属蛋白酶：细胞外基质重新塑型[3]。
4.2睫状上皮 ①调节房水生成24h节律的基因：减少夜间房水生成增加所导致的潜在性的危险眼压水平。②β肾上能受体 增进睫状体细胞对药物反应的潜能，抑制房水生成。③减少房水生成的其他基因(神经多肽链)：调整小梁网和睫状肌的功能[3]。
4.3睫状肌细胞 ①X基因：上调前列腺素的合成；②金属蛋白酶：产生基质金属蛋白酶，增加葡萄膜巩膜通道房水流出[3]。
4.4视网膜神经节细胞 ①神经营养素受体(TrkB) ：增加RGC对神经营养因子反应的潜能；②神经营养素基因(BcIX)：增加内源性抗凋亡基因产物水平以拮抗BAX功能；③Bax基因：反义结构以减少BAX蛋白水平；④Hsp70/72基因：增进RGC对内源性刺激反应能力，以抵抗损害性刺激[3]。
4.5 Müller细胞 ①GLAST：上调内源性谷氨酸盐运输体，增进细胞外基质谷氨酸盐水平；②神经营养素基因：为RGC提供神经营养素的替代资源[3]。
5青光眼基因治疗存在的问题和展望
基因治疗最常见的负面反应表现在前房内出现的主要由单核细胞浸润组成的炎症反应。这种反应在灵长类比啮齿类更常见，至少发生在HSV载体中。在注射高浓度腺病毒载体时，兔眼和猴眼都可能出现严重的炎症反应，这可能与载体病毒诱导的炎症前细胞激酶的作用有关。而且，这种炎症反应是剂量依赖性的，但AAV和LV载体并不诱导炎症反应。
目前,青光眼基因治疗在眼科领域尚处于实验起始阶段,既面临基因治疗普遍碰到的问题,也有青光眼治疗中的特殊问题,还有许多理论、技术等方面的问题亟待解决。我们需要更好地理解小梁细胞的细胞外基质，细胞骨架改型和细胞信号事件；更好地理解房水的产生和调节，睫状上皮释放的能改变小梁网功能的因子；更好地理解RGC在经受各种刺激和升高与不升高眼压条件下细胞死亡的激活通路；更好地理解机体对各种载体系统的内在的和抗原特性的免疫反应；更好地理解这些反应在啮齿类和灵长类动物的差别以减轻这些反应类型。同时需要能够模仿导致眼压升高的小梁网和睫状上皮变化的动物模型以检测基因治疗的效果。努力确认与青光眼相关的其他基因将为更好的基因治疗策略提供重要线索。最后，关键是要理解为什么源于不同载体的异位基因表达会在不同的眼组织细胞中终止；关键是要证实启动子或其他基因表达元件能够提供长期的转基因表达[3]。
总之，随着分子生物学的飞速与基因工程的日新月异,过去的困难现已迎刃而解,相信在不久的将来，青光眼基因治疗一定会在临床上逐步展现其优越性。
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1 Nash MS, Osborne NN. Assessment of Thy-1 mRNA levels as an index of retinal ganglion cell damage. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1999;40:1293-1298
2 Loewen N, Fautsch MP, Peretz M, Bahler CK, Cameron JD, Johnson DH, Poeschla EM. Genetic modification of human trabecular meshwork with lentiviral vectors.Hum Gene Ther ,2001;12(17):2109-2119
3 Borras T, Brandt CR, Nickells R, Ritch R. Gene therapy for glaucoma: treating a multifaceted, chronic disease. Invest Ophthalmol Vis Sci .2002;43:2513-2518
4 Borras T, Rowlette LL, Erzurum SC, Epstein DL. Adenoviral reporter gene transfer to the human trabecular meshwork does not alter aqueous humor outflow. Relevance for potential gene therapy of glaucoma. Gene Ther ,1999;6:515-524
5 Flotte TR. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther ,2004;11(10):805-810
6 Spencer B, Agarwala S, Miskulin M, Smith M, Brandt CR. Herpes simplex virus-mediated gene delivery to the rodent visual system. Invest Ophthalmol Vis Sci .2000;41:1392-1401
7 Liu X, Brandt CR, Gabelt BT, Bryar PJ, Smith ME, Kaufman PL.Herpes simplex virus mediated gene transfer to primate ocular tissues. Exp Eye Res ,1999;69:385-395
8 Loewen N, Fautsch MP, Peretz M, Bahler CK, Cameron JD, Johnson DH, Poeschla EM . Genetic modification of human trabecular meshwork with lentiviral vectors. Hum Gene Ther .2001;12:2109-2119
9 Lotery AJ, Derksen TA, Russell SR, Mullins RF, Sauter S, Affatigato LM, Stone EM, Davidson BL. Gene transfer to the nonhuman primate retina with recombinant feline immunodeficiency virus vectors. Human Gene Therapy ,2002;13: 689-696
10 Loewen Nils, Leske DA, Cameron JD, Chen Y, Whitwam T, Simari RD, Teo WL, Fautsch MP, Poeschla EM, Holmes JM. Long-term retinal transgene expression with FIV versus adenoviral vectors. Mol Vis ,2004;10:272-280
11 Hangai M, Kaneda Y, Tanihara H, Honda Y. In vivo gene transfer into the retina mediated by a novel liposome system. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1996;37:2678-2685
12 Hangai M, Tanihara H, Honda Y, Kaneda Y. Introduction of DNA into the rat and primate trabecular meshwork by fusogenic liposomes. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1998;39:509-516
13 Hart SL, Harbottle RP, Cooper R, Miller A, Williamson R, Coutelle C. Gene delivery and expression mediated by an integrin-binding peptide.Gene Ther. 1995;2(8):552-554. Erratum in: Gene Ther ,1996;3(11):1032-1033
14 Sears ML, Yamada E, Cummins D, Mori N, Mead A, Murakami M. The isolated ciliary bilayer is useful for studies of aqueous humor formation. Trans Am Ophthalmol Soc ,1991;89:131-152; discussion 152-154
15 Borras T, Matsumoto Y, Epstein DL, Johnson DH. Gene transfer to the human trabecular meshwork by anterior segment perfusion. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1998；39:1503
16 Budenz DL, Bennett J, Alonso L, Maguire A. In vivo gene transfer into murine corneal endothelial and trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1995;36:2211-2215
17 Borras T, Rowlette LL, Erzurum SC, Epstein DL. Adenoviral reporter gene transfer to the human trabecular meshwork does not alter aqueous humor outflow. Relevance for potential gene therapy of glaucoma. Gene Ther ,1999; 6(4):515-524
18 Wu L, Chen XH. Advances of glaucomatous optic neupoprotection therapy. Int J OphthalmolGuoji Yanke Zazhi) ,2004;4(3):496-499
19 Di Polo A, Aigner LJ, DunnRJ, Bray GM, Aguayo AJ. Prolonged delivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Muller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci USA ,1998;95:3978-3983
20 Martin KR, Quigley HA, Zack DJ, Levkovitch-Verbin H, Kielczewski J, Valenta D, Baumrind L, Pease ME, Klein RL, Hauswirth WW.Gene therapy with brain-derived neurotrophic factor as a protection: retinal ganglion cells in a rat glaucoma model. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2003;44:4357-4365
21 Dingwell KS, Holt CE, Harris WA. The multiple decisions made by growth cones of RGCs as they navigate from the retina to the tectum in Xenopus embryos. J Neurobiol ,2000;44(2):246-259
22 Wang XF, Cui JZ, Prasad SS, Matsubara JA. Altered gene expression of angiogenic factors induced by calcium-mediated dissociation of retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci , 2005;46(4):1508-1515
23 Sapieha PS, Peltier M, Rendahl KG, Manning WC, Di Polo A. Fibroblast growth factor-2 gene delivery stimulates axon growth by adult retinal ganglion cells after acute optic nerve injury. Mol Cell Neurosci ,2003;24:656-672
24 van Adel BA, Kostic C, Deglon N, Ball AK, Arsenijevic Y. Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal ganglion cells for an extended period of time. Human Gene Therapy ,2003;14:103-115
25 Takita H, Yoneya S, Gehlbach PL, Duh EJ, Wei LL, Mori K. Retinal neuroprotection against ischemic injury mediated by intraocular gene transfer of pigment epithelium-derived factor. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2003;44:4497-4504
26 Kretz A，Kugler S，Happo ld C. Excess Be l-XL increases the intrinsic growth potential of adult CNS neurons in vitro．Mol Cell Neurosci ,2004,26:63-74
27 Liu ZH, Effect of trabeculectomy with 5-fluopoupacil. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) ,2005;5(3):568-570
28 Cao XZ, Zhang W, Regulation technique and eficacf of trabeculectomy. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) ,2006;6(4):837-839
29 Perkins TW, Faha B, Ni M, Kiland JA, Poulsen GL, Antelman D, Atencio I, Shinoda J, Sinha D, Brumback L, Maneval D, Kaufman PL, Nickells RW. Adenovirus-mediated gene therapy using human p21WAF-1/Cip-1 to prevent wound healing in a rabbit model of glaucoma filtration surgery. Arch Ophthalmol ,2002;120:941-949
30 Wen SF, Chen Z, Nery J, Faha B. Characterization of adenovirus p21 gene transfer, biodistribution, and immune response after local ocular delivery in New Zealand white rabbits. Exp Eye Res ,2003;77:355-365
31 Heatley G, Kiland J, Faha B, Seeman J, Schlamp CL, Dawson DG, Gleiser J, Maneval D, Kaufman PL, Nickells RW. Gene therapy using p21WAF-1/Cip-1 to modulate wound healing after glaucoma trabeculectomy surgery in a primate model of ocular hypertension. Gene Ther ,2004,11:949-955
32 Yoon KC, Yang KJ, Seo JS, Lee SE, Heo T, Chun BJ, Jung S, Kim KK, Ahn KY. Effect of human RAD50 gene therapy on glaucoma filtering surgery in rabbit eye. Curr Eye Res ,2004;28:181-187
