大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞
作者：姜廷帅 蔡莉 惠延年 闫峰
AbstractAIM: To explore the plasticity of transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSC) into corneal epithelial cells. METHODS: MSC of adult rats that were isolated and purified by density gradient centrifugation combined with an attachment culture method. The transdifferentiation of MSC into corneal epithelial cells were induced in vitro by co-cultured with corneal stromal fibroblasts. The expression of K12 on MSCs which is expressed specially in corneal epithelial cells was identified by immunofluorescent staining. RESULTS: MSC cultured in vitro showed great potential of proliferation. CD29 was positive, and CD34, CD45 were negative in cultured cells, indicating that the cultured cells were MSC. After co-cultured with corneal stromal fibroblasts for one week, MSC expressed K12, indicating that they had been transdifferentiated into corneal epithelial cells. CONCLUSION: The data suggests that MSC have the potential to transdifferentiate into corneal epithelial cells in vitro.
· KEYWORDS: mesenchymal stem cell; corneal epithelial cells; transdifferentiation
摘要目的:探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC，经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化，免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达。 结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能，原代培养的骨髓MSC CD29免疫荧光染色阳性，CD34和CD45为阴性，符合骨髓MSC的特征。MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞，少部分细胞形态上相对偏小，免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12。 结论:体外培养的MSC在角膜基质细胞的诱导下可横向分化为角膜上皮细胞。
关键词:骨髓间充质干细胞；角膜上皮；细胞分化
0引言
角膜上皮再生的来源是角膜缘干细胞，角膜缘干细胞的缺失会导致严重的眼表异常。采用自体或同种异体角膜缘移植，可一定程度的重建眼表，但因供体来源不足及异体移植引起的排斥反应而受限；而单纯羊膜移植重建眼表，因无上皮再生来源的干细胞而不能角膜缘严重受损的眼表损伤。组织工程技术的为解决这一问题带来了希望。成年人骨髓中存在着多向潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞。我们对骨髓MSC向角膜上皮细胞的分化潜能做一些初步的探索，从而探讨骨髓MSC作为构建组织工程化角膜的种子细胞的可行性。
1材料和方法
1.1材料 PBS液(含青链霉素100kU/L)；细胞培养基(DMEM/Ham’s F12 ,10 mL/L胎牛血清)；2.5g/L胰蛋白酶；中性蛋白酶dispaseⅡ；Percoll储存液（密度1077g/L）；兔抗大鼠CD29，CD34，CD45mAb（美国Chemicon公司）、兔抗大鼠角蛋白K12mAb（美国Santa Cruz公司），山羊抗兔FITC标记二抗（北京中山生物技术公司），跨室培养装置（Transwell，孔径0. 45μm，美国Millipore公司）。
1.2方法
1.2.1大鼠骨髓MSC的分离培养 取4wk龄SD大白鼠，雌雄不限，断颈处死后于750mL/L乙醇中浸泡10min。无菌条件下用外科剪于大鼠的股骨端将大腿剪下，剪去胫骨，用眼科剪剪开皮肤，分离去除肌肉，剪去股骨两端的膨隆部分，暴露骨髓腔，用含肝素的PBS液冲洗骨髓腔，收集于培养皿，如此反复数次。在一无菌离心管中，加入Percoll液0.6mL和8.5g/L NaCl溶液0.4mL，混匀配制成密度为1 077g/L的细胞密度梯度分离液。将收集的细胞悬液缓慢加在分离液的上部，2 000r/min离心30min，去除上清。PBS洗2次，按2×108/L密度接种细胞于75mL塑料培养瓶中。接种48h后换液，以后每2～3d换液，观察细胞增殖能力及形态学特征（倒置显微镜）。另将原代培养的MSC接种于盖玻片上，待细胞长出后，用PBS离心洗涤 （1 000r/min，5min）2次，把细胞片浸入950mL/L乙醇中固定。将已经固定的细胞玻片放入盖片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。滴加滴度为1∶32～64的特异性抗体(一抗，CD29，CD34，CD45，K12)，置于湿盒内，37℃保温孵育60min，另以PBS代替一抗作阴性对照。随后PBS振洗3次，吹干。滴加适当稀释的荧光素标记抗体（二抗，FITC标记的山羊抗兔IgG），置于湿盒内，37℃保温30min。PBS振洗2次，然后用蒸馏水振洗1次。500mL/L缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察并照相记录。
1.2.2角膜基质细胞的制备 无菌条件下摘取大鼠眼球，沿角膜缘处分离出整个角膜，先用普通消化液浸泡，置于37℃30min ，再用dispaseⅡ于37℃消化2～3h 。消化后用PBS 洗去消化下来的上皮细胞。在显微镜下观察，若发现细胞未消化干净，用眼科小镊子轻轻刮取细胞，确保角膜上皮细胞完全被消化下来。将角膜基质剪成1mm×1mm大小的组织块，放入离心管中加入4mL胶原酶，将离心管倾斜放入37℃孵箱内，每隔5min振摇一次，消化1h。收集消化液，过100目不锈钢网过滤，800r/min离心，5min，去除上清，用PBS离心漂洗1～2次，去除上清，按1×107/L密度接种于25mL培养瓶中。
1.2.3大鼠骨髓MSC与角膜基质细胞共培养 按Millipore公司的说明，用Transwell共培养体系（跨室培养器，孔径0.45μm）装置进行大鼠骨髓间充质干细胞与角膜基质细胞的共培养。共培养体系中上、下层的细胞被隔开，培养液和可溶性因子可以自由通过，细胞无法通过。在6孔培养板中以1×108/L的密度接种第2代MSC，其中3个孔放置Transwell小室作为诱导组，另外3个孔不放置Transwell小室作为对照组。在Transwell小室中接种大鼠角膜基质细胞（第2代），滴加40μg/L表皮生长因子（EGF），共培养7d后，间接免疫荧光法检测抗角膜上皮细胞特异性角蛋白K12在与角膜缘基质细胞共培养的骨髓间充质干细胞中的表达（方法同前）。
2结果
2.1 MSC生长特征 培养3d细胞开始伸展，换液去除未贴壁细胞可见贴壁生长的MSC数量较少，散在分布，体积较大，呈纺锤形或梭形。7d后开始出现较大的克隆，贴壁细胞迅速增殖，为成纤维细胞样，胞质丰富，核大，贴壁牢，不易消化(图1)。14d后细胞融合，呈漩涡状排列(图2)。培养的大鼠原代MSC表达间质细胞标记CD29（图3），不表达造血干细胞标记CD34，CD45，角蛋白K12染色阴性，符合骨髓MSC特征。
2.2角膜基质细胞的形态特征 培养2d可见细胞伸展，呈梭形或不规则三角形。细胞核为椭圆形位于中央，细胞质向外伸展突起。3d后，细胞数量逐渐增多，呈放射状排列生长。原代细胞培养7d，细胞达融合状态(图4)。传代后细胞生长迅速，约5d左右融合。将第2代的细胞用于共培养体系。
2.3 MSC共培养后特征 诱导组MSC经7d的共培养诱导，大部分细胞体积变大，细胞呈多角形，细胞质比例明显增大，分化为间质细胞，小部分细胞形态上相对偏小，细胞核明显，散在分布(图5)。免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12，周围未染色细胞为分化为间质的细胞(图6)。对照组MSC细胞体积变大，细胞进一步融合呈漩涡状排列（图7）。免疫荧光染色检测不表达角蛋白K12（图8）。
图1 体外培养的大鼠原代骨髓MSC，呈成纤维细胞样，纺锤形或梭形（7d×200）
图2 融合后的大鼠原代MSC，呈漩涡状排列（14d×100）
图3 体外培养MSC CD29表达阳性（IF×100）
图4 体外培养的大鼠角膜基质细胞（7d×100）
图5 共培养诱导后的MSC（7d×200）
图6 共培养诱导后的MSC K12阳性（IF×100）
图7 对照组未诱导的MSC（7d×100）
图8 对照组未诱导MSC K12阴性（IF×100）
3讨论
眼表由角膜上皮、结膜上皮和泪膜3部分组成，眼表的稳定对维持角膜的透明性具有非常重要的作用。其中，角膜上皮细胞再生的来源是角膜缘干细胞，干细胞缺失会导致严重的眼表异常，进而造成角膜混浊，危害视力。目前，对这类疾病尚无理想的方法。 临床采用自体角膜缘干细胞移植对部分患者有良好疗效，但是，当双眼均发生大面积眼表损害时，健康角膜缘干细胞的来源受限[1,2]。近年研究发现，成年人骨髓中存在着具有多向分化潜能的 MSC[3]，在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞[4-6] 。这类细胞来源确切、充足，取材方便，分化潜能大，避免了胚胎干细胞可能面临的伦问题，并且因为是自体组织，所以不存在排斥反应，可能具有更加良好的应用前景。研究表明，角膜基质是角膜上皮细胞和角膜缘干细胞的微环境，具有维持角膜上皮细胞特性的作用，特别是角膜缘基质维持角膜缘干细胞特性的作用是肯定的[7]。角膜缘基质含有多种自分泌和旁分泌细胞因子及其受体，共同组成了角膜缘基质层复杂的细胞因子调控微环境，维持角膜缘干细胞的正常分化、繁殖和不进入终极分化，在角膜缘永存。以往国内外研究多采用角膜缘干细胞作为眼表重建组织工程的种子细胞，虽然角膜缘干细胞作为种子细胞的研究已得到相当的进展,但其部位的局限性以及材料的难获得性限制了进一步的研究。本实验旨在为角膜的组织工程寻找更多更好的种子细胞，尤其是当眼表严重损伤，角膜缘细胞完全或大部分丧失不能修复眼表，用骨髓MSC替代角膜缘细胞进行移植具有重要的临床应用价值。利用角膜基质细胞模拟角膜缘干细胞生长的微环境与MSC在Transwell体系中共培养，诱导MSC向角膜上皮细胞分化，国内外尚未见报道。角膜基质具有诱导非角膜细胞向角膜上皮细胞分化的能力[8]，运用Transwell共培养体系能较好的模拟体内生长环境，上下层细胞不发生直接接触，0.45μm孔径的聚碳脂膜可以保证细胞因子正常通过而细胞不会通过，因此不会发生细胞间的污染。基质细胞分泌的细胞因子及外源性细胞因子（EGF）共同组成了MSC分化所需的复杂细胞因子调控微环境，促进MSC向角膜上皮分化。共培养后的细胞可以表达角膜上皮特异性角蛋白K12，说明在特定的条件下，MSC可以向角膜上皮定向分化。我们利用组织工程技术体外培养MSC，与角膜基质细胞共培养诱导MSC向角膜上皮转化，体外重建角膜上皮组织, 为进一步行组织工程化角膜上皮层移植奠定了理论和实验基础，为角膜组织工程中种子细胞的来源开辟了一个新的途径，然而其具体的分子机制仍有待进一步的研究。
【】
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