VEGF 基因在胃癌中的表达及其意义
【摘要】 目的：探讨VEGF基因在胃癌组织中的表达及意义。方法：采用逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)检测48 例胃癌组织及30 例正常组织中VEGF基因的表达。结果：48 例胃癌组织标本中有29 例表达VEGF基因，而30 例正常组织均不表达VEGF基因，两组比较差异有显著性(P<0.05) 。结论：VEGF基因在胃癌组织中有较高的表达,对胃癌病人的免疫和预后有重要意义。
【关键词】 VEGF基因； 胃癌； 逆转录PCR
胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其恶性程度与各种癌基因、肿瘤抑制因子及几种生长因子及其受体异常有关［1~4］。血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor， VEGF)是恶性肿瘤细胞分泌的一种细胞因子，在促血管生成的各种调节因子中，VEGF是作用最强的一种促血管生成因子，可以促进肿瘤组织中新生血管的形成,从而有利于肿瘤的生长及进展。然而，VEGF在胃癌表达的分子机制尚未清除。本研究用RT?PCR方法研究胃癌组织的和VEGF的表达,为胃癌的发生、、肿瘤组织中血管形成、转移及治疗提供新的途径和理论依据。
1 材料和方法
1?1 材料所有标本均来自本院2004年9～2006年9月间的外科手术及胃镜标本。包括癌组织及距癌灶5cm以上的癌旁组织，共收集标本48例，其中男性28例，女性20例；高中分化27例，低分化21 例，20例可见淋巴结转移；年龄24～78 岁，平均年龄61.7岁。所有患者术前未经过化疗或放疗，病理类型为粘液腺癌、管状腺癌、印戒细胞癌。Trizol购自invitrogen公司，cDNA合成试剂盒购自MBI公司。
1?2 方法
1?2?1 RNA 的提取 Trizol法提取总RNA：组织块（约100mg）置匀浆器，加Trizol（约2ml）冷冻匀浆，室温孵育5min，加入氯仿（0.2ml氯仿/1mlTrizol）用力振荡15秒，室温孵育2~3min，4℃，12000rpm离心15min，取上清，加入异丙醇（0.5ml异丙醇/1mlTrizol），室温孵育60min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，75%乙醇洗涤沉淀一次（至少1ml75%乙醇/1mlTrizol），4℃，7500rpm离心5min，弃上清，风干沉淀，加DEPC处理水溶解RNA，-80℃保存备用。
1?2?2 cDNA 的合成 反应体积为20μL，反应条件如下：MgCl2 5mmol/ L，10 ×逆转录缓冲液2μL, dNTP1mmol/ L ,逆转录酶15U ,核酸酶抑制剂0.5 U，Oligo (dT) 15 引物0. 5μg ,模板RNA 1 ug，加无RNase水至终体积20μL。42 ℃反应1h ，99 ℃加热5min，然后快速冷却至4 ℃，以灭活逆转录酶,并防止逆转录酶与cDNA结合，逆转录得到的cDNA用作PCR反应的模板。
1?2?3 PCR引物 合成VEGF引物及内参照GAPDH 引物。VEGF引物序列为： 5'ATGGCAGAAGGAGGAGGG 3’和 5'CGAAACGCTGAGGGAGGCT 3'，GAPDH 的引物为：5’?CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA ?3’和5’?ATGATC TTGAGG CTG TTG TCA TA ?3’。
1?2?4 PCR 扩增 两对引物的反应体系均为25μL, VEGF 反应体系包括cDNA 产物2μL, MgCl2 1. 5mmol/ L, 10 ×Buffer 2. 5μL，dNTP 0. 04 mmol/ L ,引物浓度0. 5μmol/ L, Taq 酶1U，加去离子水至终体积25μL，混匀后滴加无菌石蜡油覆盖液面，瞬时离心后置PCR 扩增仪中扩增扩增条件为94 ℃预变性5min，然后94 ℃55 sec ,50 ℃55 sec ,72 ℃1min24sec，共35个循环,最后72 ℃延伸5min。GAPDH 反应体系包括：cDNA模板2μL ，MgCl2 1. 5mmol/ L，10 ×Buffer2. 5μL , dNTP 0. 2mmol/ L ，引物0. 5umol/ L ，Taq 酶1U ；PCR 扩增条件为94 ℃1min ,55 ℃1min ,72 ℃1min 24sec，共30 个循环,然后72 ℃延伸5min。取10μL 扩增产物于含溴化乙锭的1. 5%琼脂糖凝胶中电泳, 80V, 1h，紫外透射仪观察结果，VEGF基因阳性扩增条带为420bp ，内参照基因GAPDH 扩增条带为200bp 。
1?3 统计学分析数据用SPSS10. 0 软件处理,两组比较采用χ2检验。
2 结果
GAPDH 作为内参照,在所有组织标本中均有稳定表达,用以证实实验结果的可靠性。48 例胃癌组织标本中有29例，30例相应正常组织均不表达VEGF基因（图1）,两组比较P<0.05,差异有显著性。
1分子量标准；2、3癌组织；4癌旁组织
图1 VEGF基因的RT-PCR检测（略）
本研究对VEGF基因表达与不表达的胃癌病人进行了临床资料分析, VEGF基因的表达与年龄、性别、大小、组织学类型无关, 但与肿瘤的浸润深度、临床分期及淋巴系统转移具有显著的相关性(P<0.05)，见表1。
表1 VEGF表达与胃癌临床病理指数的关系（略）
3 讨论
胃癌是我国高发恶性肿瘤之一，手术仍是主要的手段，然而对于术后复发和转移以及不能手术的晚期病人，手术以外的其它治疗就显得尤为必要。化疗虽是一种重要的辅助治疗方法,但出于肿瘤的耐药性以及化疗药物的严重副作用，其应用受到一定限制。放疗则出于肿瘤的大小和部位不同以及放疗的副作用,使某些肿瘤对放疗不敏感，因此建立特异的肿瘤免疫疗法，使其成为重要的辅助治疗手段有助于推动肿瘤的治疗研究。肿瘤血管生成是胃癌生存最重要的预测因子，一些关键的血管生成因子如同样可以作为胃癌预测的独立因子，在促血管生成的各种调节因子中，VEGF是作用最强、最特异、最重要的一种促血管生成因子［5］。本研究发现人胃癌细胞中VEGF的表达与性别、年龄、大小无关，但与浸润深度、淋巴结转移、临床分期密切有关，且胃癌的表达明显高于癌旁细胞的表达。VEGF的表达促进胃癌血管生成，使胃癌血管数目增多，血管通透性增加，血管内物质渗出增多，胃癌细胞得到更多的氧和营养物质，增殖加快［6］。因而，VEGF的表达可能与胃癌的发生和转移有关。
【】
1 Tahara E. Molecular aspects of invasion and metastasis of stomach cancer. Verh Disch Ges Pathol, 2000,84: 43~49.
2 Chan AO, Luk JM, Hui WM, et al. Molecular biology of gastric carcinoma: from laboratory to bedside. J Gastroenterol Hepatol, 1999, 14: 1150~1160.
3 Xie K, Huang S. Regulation of cancer metastasis by stress pathways. Clin Exp Metastasis, 2003, 20: 31~43?
4 Siewert JR, Bottcher K, Stein HJ, et al. Relevant prognostic factors in gastric cancer: ten?year results of the German Gastric Cancer Study. Ann Surg， 1998, 228: 449~461.
5 Yoshikawa T, Tsuburaya A, Kobayashi O, et al. Plasma concentrations of VEGF and bFGF in patients with gastric carcinoma. Cancer Lett, 2000, 153: 7~12?
6 Shibata A, Nagaya T, Imai T, et al. Inhibition of NF?kappa B activity decreases the VEGF mRNA expression in MDA?MB?231 breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat, 2002, 73: 237~243.
