抑癌基因PTEN在上皮性卵巢癌中的表达及其与uPA、MMP
作者：徐京晶 朱润庆 李铭 赵恒敏
【关键词】 卵巢癌；免疫组织化学；原位分子杂交；
摘要：为探讨抑癌基因PTEN表达在卵巢癌发生和演进中的作用及其与uPA、MMP2的相互关系，对8例正常上皮来源的卵巢组织、18例卵巢交界性肿瘤、60例上皮性卵巢癌石蜡切片组织，应用免疫组织化学SP法检测PTEN蛋白、MMP2蛋白的表达，分子原位杂交法检测uPA蛋白的表达。结果显示，PTEN在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤、上皮性卵巢癌中的阳性表达率分别为87.50%（7/8）、50.00%（9/18）、23.33%（14/60），PTEN的阳性表达率在上皮性卵巢癌中低于正常卵巢、卵巢交界性肿瘤，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)；I/II期阳性表达率37.50%明显高于III/IV期的13.89%（P<0.05）；卵巢内膜样癌PTEN阳性表达率7.14%，显著低于浆液样34.78%或黏液样囊腺癌44.44%（P<0.05）。PTEN表达与uPA表达呈负相关（P<0.05），与MMP2表达呈负相关（P<0.01）。
关键词：卵巢癌；免疫组织化学；原位分子杂交；
PTEN肿瘤的发生与多种癌基因及抑癌基因的异常激活、表达有关，肿瘤的侵袭和转移是一多步骤、多因素参与的极其复杂的过程，涉及肿瘤细胞的黏附、分离、迁移，基底膜及细胞外基质的降解，肿瘤新生血管生成的诸多方面。PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在生长因子的细胞信号传递中起着复杂而重要的作用，通过抑制细胞有丝分裂、诱导细胞凋亡、参与调节细胞的黏附、转移和分化等发挥抑癌基因的作用。尿激酶型纤维蛋白激活系统（uPA）通过水解纤溶酶原转变为纤溶酶降解细胞外基质进而使肿瘤不断浸润和扩散。金属基质蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质组分时最重要的一大分子蛋白。我们应用免疫组化、分子原位杂交技术检测正常卵巢、卵巢交界性肿瘤和上皮性卵巢癌中PTEN、uPA、MMPs的表达，探讨其在卵巢癌发生及演进中的作用及其在卵巢癌预后评估中的意义。
1材料和方法
11标本来源
研究标本86例取自武汉市第八1999年~2005年病理存档的石蜡标本，所有手术患者术前均未接受过放疗、化疗或激素，诊断均经常规病理切片证实。患者年龄32~65岁，中位年龄48岁。正常上皮来源的卵巢组织8例，卵巢交界性肿瘤18例，上皮性卵巢癌60例（其中浆液性囊腺癌23例，黏液性囊腺癌9例，卵巢内膜样癌28例；高~中分化卵巢癌25例，中~低分化卵巢癌35例；按FIGO分级，I/II期24例，III/IV期36例；卵巢癌伴淋巴结转移15例，无淋巴结转移45例）。
12实验试剂
鼠抗人PTEN单克隆抗体、尿激酶型纤溶酶型活化因子即用型原位杂交试剂盒、鼠抗人MMP2单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。
13方法
石蜡块标本制成4μm厚的切片，免疫组织化学染色程序按SP试剂盒说明进行，PBS代替一抗作阴性对照，已知乳腺癌阳性片作阳性对照。PTEN阳性表达为淡黄色至棕褐色物质，定位于细胞浆，高倍镜下每张切片选5个视野，每个视野记数100个细胞。(-)：<25% ; (+)：>25%。MMP2以细胞出现棕黄色颗粒为阳性判定标准，MMP2表达的判定以染色强度和阳性细胞百分率的得分之积进行评估。（-）：0；（+）：1~3；（++）：4~6；（+++）：7~9。分子原位杂交按试剂盒说明，以未加入探针的预杂交液代替探针作为空白对照，已知乳腺癌阳性片作阳性对照。每张切片在高倍镜下随机选取10个视野，各实验阳性细胞的平均百分数，阳性染色均为细胞质着色呈棕黄色颗粒。根据着色范围划分，（-）：无阳性染色细胞或着色率<5%；（+）：阳性细胞数5%~25%；（++）：阳性细胞数25%~50%；（+++）：阳性细胞数>50%。
14统计学处理
所有数据采用CS2000软件包分析，根据适用条件以Pearson未校正法或Yates校正法计算χ2值, 或直接用确切概率法计算P值。PTEN、uPA与MMP2的表达关系采用配对四格表的相关分析Yates校正法。
2结果
21PTEN在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤、上皮性卵巢癌中的表达
PTEN在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤、上皮性卵巢癌中的阳性表达率分别为 87.50%（7/8）、50.00%（9/18）、23.33%（14/60），PTEN的阳性表达率在上皮性卵巢癌中低于正常卵巢、卵巢交界性肿瘤，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。
22PTEN表达与卵巢癌临床病理分期的关系
PTEN表达与卵巢癌的临床病理分期呈负相关（P<0.05），I/II期阳性表达率高于III/IV期，差异有显著性。在卵巢癌的组织类型中，卵巢内膜样癌PTEN表达最低，显著低于浆液样或黏液样囊腺癌（P<0.05）。PTEN表达与卵巢癌的分化程度及有无淋巴结转移无明显相关（P>0.05）。
23卵巢癌组织PTEN表达与uPA、MMP2表达的关系
uPA表达阳性的卵巢组织中，PTEN的表达率为16.67 %（8/48）；uPA表达阴性的卵巢组织中，PTEN的表达率为50.00 %（6/12），两者的表达呈负相关（P=0.0394<0.05， R= -0.3152）；MMP2表达阳性的卵巢组织中，PTEN的表达率为15.38%（8/52）；MMP2表达阴性的卵巢组织中，PTEN的表达率为75.00%（6/8），两者的表达呈负相关（P=0.0011 <0.01，R= -0.4791）。表1卵巢癌PTEN的表达与临床病理特征及与uPA、MMP2蛋白表达的关系
3讨论
肿瘤抑制基因PTEN在细胞凋亡、迁移和肿瘤演进中发挥作用。目前，研究发现PTEN通过突变、杂交性缺失（LOH）、过甲基化、微卫星不稳定或转录抑制等遗传学改变，导致PTEN基因表达"沉默"［1］。PTEN基因的突变和纯合性丢失见于多种原发性恶性肿瘤，包括子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、肾癌、前列腺癌、卵巢癌等，提示其与多种肿瘤的发生、关系密切。PTEN基因定位于染色体10q23.3上［2］，其编码的产物PTNE蛋白是由403个氨基酸组成的一条多肽链［3］，有四个结构域，具有蛋白磷酸酶和脂磷酸酶的双重特异活性。PI3K/PIP3/Akt胞内信号传导通路对细胞的分裂周期起着正性调控作用，经一系列级联反应最终促使细胞有丝分裂增强，凋亡受到抑制［4］。PTEN的磷酸酶活性促使PIP3的3'位点脱磷酸化，抑制依赖PIP3激活的丝、苏氨酸激酶PKB/Akt活性，影响其下游通路的作用靶因子，包括BAD、G1期CDK抑制因子P27、翻译抑制因子4EBP1等的磷酸化水平，从而诱导凋亡，并介导G1期停顿，影响基因的表达，从而抑制细胞增殖。MARK信号通路能活化cfos、TCF、 CJun等核转录因子而促进细胞分裂增生，PTEN对MAPK通路的多种上游信号分子具有去磷酸化调节的作用，影响细胞生长［5］。FAK是整合素信号传导通路的关键性调控因素，引起细胞基质局部粘附以及细胞骨架蛋白的组装。PTEN能对FAK及其通路中多种信号分子予以脱磷酸化调节，影响其正常信号传导，导致细胞局部粘附和运动迁移功能受到抑制［6］。
本研究结果显示，PTEN表达在卵巢癌发生过程中逐渐降低，提示PTEN基因表达在卵巢癌发生中作为早期分子事件发挥重要作用。PTEN表达与卵巢癌的临床病理分期呈负相关，提示PTEN表达下调可能与卵巢癌的演进关系密切。在卵巢癌的组织类型中，卵巢内膜样癌PTEN表达水平显著低于浆液性或黏液性囊腺癌，提示PTEN基因与卵巢内膜样癌的发生和病理生物学行为关系更为密切，支持起源于异位子宫内膜的卵巢内膜样癌的发生途径与其他卵巢上皮源性癌不同的观点。
尿激酶型纤维蛋白激活系统（uPA）在肿瘤的侵袭转移中起重要的调节作用。uPA与uPAR结合，降解ECM等主要结构成分，还与整合素结合形成uPAR整合素复合物［7］，在Caveolin蛋白的协助下，将细胞外的信号传递至细胞内， Src家族的酪氨酸酶的磷酸化及焦点粘附激酶（focal adhesion kinase, FAK）酪氨酸磷酸化等，最终通过细胞骨架蛋白重排，促进细胞增殖、迁移。ECM降解后，释放大量储存于ECM的生长因子，VEGF、FGF等与受体结合后直接刺激肿瘤及肿瘤新生血管形成，并上调内皮细胞表达uPA/uPAR，形成正反馈调节环，极大增加uPA产物，为内皮细胞迁移、增殖及肿瘤新生血管形成创造有利的微环境。本实验证明卵巢癌中PTEN和uPA的表达呈负相关。PTEN对uPA的影响为下调FAK等的磷酸化水平，阻断整合素介导的细胞局部粘附与迁移，此外，PTEN通过影响VEGF的信号传导通路及下调VEGF的转录表达，降低了正反馈调节环作用，不利于uPA作用的肿瘤增殖、新生血管形成、迁移等。近来研究表明，转化生长因子TGFβ1与肿瘤细胞的侵袭能力呈正相关［8］。Tanaka等［9］认为TGFβ1通过两种不同的（SrcMAPKPI3KNFκB依赖的和SrcMAPKAP1依赖的）信号途径上调uPA的表达。由此而来，PTEN通过此途径下调uPA的表达。
金属基质蛋白酶(MMPs)为肿瘤侵袭另一重要因素，它们几乎能降解细胞外所有成分。本实验证明卵巢癌中PTEN和MMP2的表达呈负相关。MMP2的表达调控受磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）途径和有丝分裂原激活蛋白（MAPK）途径共同调节［10］，因此不难理解PTEN对MMP2的负调节作用。
总之，在卵巢癌的发生及演进过程中，PTEN基因表达降低是一个重要的分子事件。对PTEN作用机制与功能的全面认识，将会为肿瘤的早期诊断和预后提供新的指标，为肿瘤的临床开辟新的思路。PTEN与其它癌基因/抑癌基因调控间的关系有待进一步阐明。
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8Sewell J M, Smyth JF, Langdon SP. Role of TGF alpha stimulation of the ERK, PI3K kinase and PLC gamma pathways in ovarian cancer growth and migration. Exp Cell Res, 2005,304(1): 305~316.
9Tanaka Y, Kobayashi H, Suzuki M, et al. Transforming growth factorbeta 1dependant urokinase upregulating and promotion of invasion are involved in SrcMAPKdependent signaling in human ovarian cancer cells. J Biol Chem, 2004,219(10): 8567~8576.
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