缺氧诱导因子?1α和Endostatin在乳腺浸润性导管癌中的表达及相关性
【摘要】 目的： 探讨乳腺浸润性导管癌组织中缺氧诱导因子?1α和Endostatin的表达、两者的内在相关性及其与乳腺癌生物学行为之间的关系。 方法： 采用免疫组织化学SP方法，检测86例乳腺浸润性导管癌和12例乳腺良性肿瘤组织中缺氧诱导因子?1α和Endostatin的表达。 结果： 86例乳腺浸润性导管癌组织中缺氧诱导因子?1α阳性表达率为52.33%（45/86），Endostatin阳性表达率为46.51%（40/86），两者在乳腺良性肿瘤组织中均不表达（0/12）；缺氧诱导因子?1α和Endostatin的表达率显著高于乳腺良性肿瘤组织，缺氧诱导因子?1α和Endostatin表达率与乳腺浸润性导管癌患者临床分期、病理组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、5年生存率密切相关（P＜0.01），缺氧诱导因子?1α的表达和Endostatin呈负相关（P＜0.01）。 结论： 在乳腺浸润性导管癌组织中，肿瘤血管生成通过缺氧诱导因子?1α上调肿瘤的血管生成因子，或血管生成抑制因子Endostatin下调肿瘤的血管生成因子，来实现肿瘤组织的恶性或好转。缺氧诱导因子?1α和Endostatin的表达可能成为评价乳腺浸润性导管癌临床分期、病理组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、5年生存率等生物学重要指标。
【关键词】 乳腺癌； 缺氧诱导因子?1α； Endostatin； 免疫组织化学
乳腺癌肿瘤细胞具有生长迅速，向正常组织浸润及转移扩散的特点。近年大量研究表明，乳腺癌肿瘤细胞的这些特性都与其周围组织的血管内皮生长有关。缺氧诱导因子?1α又是调控血管内皮生长等众多靶基因表达的重要因子，它的表达水平升高使肿瘤细胞耐受缺氧，促进肿瘤生长，浸润和转移。而O＇Reilly［1］等于1997年发现的Endostatin具有抑制肿瘤血管生成和肿瘤转移最强烈、最特异的作用，能使肿瘤细胞迅速凋亡，残余肿瘤细胞进入休眠状态，但两者在乳腺癌研究中未见有报道。本研究旨在探讨乳腺浸润性导管癌组织中缺氧诱导因子?1α和Endostatin的表达、两者的内在联系及其与乳腺癌生物学行为之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
来源于武穴市人民和武汉大学中南医院病理科1996～2005年档案材料，从中选取石蜡包埋的乳腺浸润性导管癌标本共86例，年龄30～70岁（平均46.9岁），乳腺良性肿瘤12例，年龄19～58岁（平均37.0岁），均为女性。临床分期：Ⅰ期10例（11.63%）、Ⅱ期46例（53.49%）、Ⅲ～Ⅳ期30例（34.88%）；病理组织学分级：Ⅰ期10（11.63%）、Ⅱ期31（36.05%）、Ⅲ期45（52.33%）、肿瘤大小：T1组≤2cm18例（20.93%）、T2组＞2cm，≤5cm58例（67.44%）、T3组＞5cm10例（11.63%）；淋巴结转移：无转移46例（53.49%）、转移40例（46.51%）；5年生存率：＞5年50例（58.14%）、≤5年36例（41.86%）。
1.2 方法
标本经10%福尔马林溶液固定，常规脱水包埋，厚3～4μm的连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学染色，缺氧诱导因子?1α和Endostatin为兔抗人多克隆抗体，均购自武汉博士德生物工程有限公司。免疫组化步骤按SP试剂盒说明进行。PBS代替一抗作阴性对照，阳性对照片由试剂公司提供。
1.3 结果判定标准
缺氧诱导因子?1α和Endostatin以细胞核或细胞浆内有棕黄色细颗粒为阳性。两者在高倍镜下（×400），着棕黄色颗粒细胞≤25%为阴性表达，＞25%为阳性表达。
1.4 统计学处理
应用SPSS13.0软件进行统计学分析，采用χ2检验、精确概率法和Spearman等级相关分析，P＜0.01，差异在统计学上有显著性意义。
2 结果
2.1 缺氧诱导因子?1α、Endostatin在乳腺浸润性导管癌和乳腺良性肿瘤组织上的表达
缺氧诱导因子?1α阳性染色为棕黄色细颗粒，主要表达于细胞核，胞浆也有表达。Endostatin主要以细胞浆着棕黄色颗粒为主。86例乳腺浸润性导管癌组织中，缺氧诱导因子?1α阳性表达率为52.33%（45/86），Endostatin阳性表达率为46.51%（40/86），两者在1例癌组织和12例良性肿瘤组织中均无表达。缺氧诱导因子?1α、Endostatin阳性表达率明显高于乳腺良性肿瘤组织（P＜0.01）。
2.2 缺氧诱导因子?1α和Endostatin的表达与乳腺浸润性导管癌临床分期、病理组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、5年生存率的关系
表1 缺氧诱导因子?1α和Endostatin的阳性表达（略）
乳腺浸润性导管癌组织中缺氧诱导因子?1α阳性表达率随临床分期增加而增高，Endostatin阳性表达率随临床分期增加而降低，不同乳腺浸润性导管癌临床分期的缺氧诱导因子?1α和Endostatin阳性表达之间有显著差异（χ2H=72.223，χ2E=72.205，P＜0.01）；缺氧诱导因子?1α阳性表达率随病分级增加而增高，Endostatin阳性表达率随病理学分级增加而降低，不同乳腺浸润性导管癌病理学分级的缺氧诱导因子?1α和Endostatin阳性表达之间有显著差异（χH2=72.224，χ2E=72.246，P＜0.01）；缺氧诱导因子?1α阳性表达率随肿瘤增大而增高，Endostatin阳性表达率随肿瘤增大而降低，不同大小乳腺浸润性导管癌分组中的缺氧诱导因子?1α和Endostatin阳性表达之间有显著差异（χ2H=61.450，χ2E=61.257，P＜0.01）；淋巴结转移情况中，无转移或转移的缺氧诱导因子?1α和Endostatin阳性表达之间有显著差异（χ2H=32.005，χ2E=29.848，P＜0.01）；乳腺浸润性导管癌患者中生存率＞5年或≤5年的缺氧诱导因子?1α和Endostatin阳性表达之间有显著差异（χH2=33.184，χE2=31.191，P＜0.01）。
2.3 乳腺浸润性导管癌组织中缺氧诱导因子?1α和Endostatin表达的关系
表2 乳腺浸润性导管癌组织中缺氧诱导因子?1α和Endostatin表达的关系（略）
乳腺浸润性导管癌组织中缺氧诱导因子?1α阳性表达率为52.33%（45/86），Endostatin阳性表达率为46.51%（40/86），其中1例癌组织两者都无阳性表达。经Spearman等级相关分析，两者表达率呈负相关（r=-0.997 ,P＜0.01）。
3 讨论
肿瘤血管新生是肿瘤生长和转移的基础，当实体肿瘤直径大于1～2mm后［2］，它的生长就必须依靠新生血管，肿瘤如果不能血管化，生长至2～3mm便发生退化［3，4］，因此，新生血管形成是肿瘤发生中的关键环节之一。肿瘤血管生成包括血管周围细胞外基质重塑、基膜降解、内皮增殖、迁移、新生血管形成等多步骤，这一过程中有多种细胞因子参与其中，共同影响新生血管形成。O＇Reilly［1］等认为原发性肿瘤可分泌两种相互拮抗的因子，分别抑制和激活血管生成，其中缺氧诱导因子?1α和Endostatin就是两种相互拮抗的因子。
缺氧诱导因子?1［5］是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种核转录因子，在肿瘤血管生成中起核心调控作用，其中以调控血管内皮因子（VEGF）最为重要，由于肿瘤中缺氧环境及癌基因的激活和抑癌基因的突变，缺氧诱导因子?1α基因被激活并过量表达，进而识别相应靶基因，参与包括VEGF等在内的多基因的转录调控来上调VEGF的表达，诱导肿瘤新生血管生成。
Endostatin［6，7］是胶原ⅩⅤⅢ的羧基末端片段能特异性抑制血管内皮细胞增生从而有效的抑制肿瘤血管新生，体外和动物实验表明Endostatin在体外能有效抑制内皮细胞生长、移行，在体内显著退缩和停滞原发瘤、转移瘤的生长［1，2］，Endostatin可竞争性阻断VEGF诱导血管生成的信号传导通路，减少血管内皮细胞膜VEGF受体的数量，降低体内VEGFmRNA水平表达［8］，抑制肿瘤血管的生成。
本实验结果表明，缺氧诱导因子?1α和Endostatin是通过上调或下调血管生成因子［9］，如：VEGF来实现肿瘤组织的恶性发展或好转的。两者免疫组织化学评价可以作为乳腺浸润性导管癌临床分期、病理组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、5年生存率的重要生物学指标，对临床诊断及有重要的指导意义。
【】
1 O’Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997,88(2):277～285.
2 Folkman J.Amti–Amgiogenesis:New concept for Therapy of Solid Tumors . Ann. Surg. Mat, 1972,175(3):409～16.
3 Folkman J. Watson K, Inger D, et al. Induction of angiogenesis duting the transition from hyperplasia to neoplasia.Nature, 1998, 339(6219): 58～61.
4 Hanahan D, Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis, Cell, 1996, 86(3): 353.
5 Kutokawa T,Miyamoto M, Kato K, et al . Overexpression of hypoxia inducible factor 1 alpha(HIF21alpha) in oesophageal squamous cell carcinoma correlates with lymph node metastasis and pathologic stage. Br Jcancer , 2003 ,89 (6) : 10422～1047.
6 Marti HH, Risau W. Systemic hypoxia changes the organ?specific distribution of vascular endothelial growth factor and its receptors. Ptoc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(26): 15809；15814.
7 Wen W, Moses MA,Wiederschain D, et al. The generation df endostatin is mediated by elastase.Camcer Res, 1999, 59(24): 6052～6056.
8 Kim YM, Hwang S, Kim YM, et al. Endostatin blocks vascular endothelial growth factor?mediated signaling via direct interaction with KDR/FLK?1.Jbiol Chem, 2002, 277(31): 27972～27879.
9 Lund EL , Spang TM ,Skovgaard PH , et al. Tumor angiogenesis- a new therapeutic target in glioma. Acta Neutol Scand ,1998, 97: 52～62.
