119例慢性髓细胞白血病急变期核型分析
作者：朱雨，李建勇，潘金兰，吴炜，仇海荣，
吴亚芳，杨慧，张建富，陈丽娟，薛永权
【摘要】 为了探讨慢性髓细胞白血病急变期(CML-BC)核型变化及意义，应用R显带技术对119例CML-BC患者的核型资料进行分析，并在其中随机选出28例以荧光原位杂交法（FISH）检测衍生9号染色体［der(9)］是否缺失。结果表明： 124例核型检查中Ph阴性11例（8.9%）， Ph阳性113例（91.1%），其中典型易位104例（83.9%），单纯变异易位4例（3.2%），复杂变异易位5例（4.0%）； Ph阴性CML-BC中72.6%伴有附加染色体异常,主要类型是: i(17q)、+14，Ph阳性者72.3%伴有附加染色体异常,主要类型是： +Ph、+8、i(17q)；Ph阴性CML-BC急变时间为2-66月，平均29.0月，Ph阳性者急变时间为1-127月，平均34.2月，两组比较无统计学差异（P＞0.05）； FISH检测发现5例（5/28,17.9%）der(9)缺失。结论： 慢性髓细胞白血病急变期附加染色体异常多见，FISH技术可有效检测der(9)缺失。
【关键词】 慢性髓细胞白血病； 慢性髓细胞白血病急变期； 核型分析； 衍生9号染色体缺失
Karyotype Analysis in 119 Patients with Chronic Myeloid Leuke- mia at Blast Crisis
Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu Province People Hospital, Nanjing 210029, China; 1The First Affiliated Hospital of Soochow University, Jiangsu Institute of Hematology,Suzhou 215006, China
AbstractTo investigate the karyotype of chronic myeloid leukemia in blast crisis (CML-BC), karyotype analysis was performed with R-banding technique in 119 patients with CML-BC. Dual fusion fluorescence in situ hybridization (FISH) was used to detect derivative chromosome 9 deletions in randomly selected 28 cases of them. The results showed that 11 cases (8.9% ) were Ph negative;113 cases (91.1% ) were Ph positive; 104 cases (83.9%) had standard Ph translocation;9 cases (7.2% ) showed variant translocation, including 4 cases (3.2%) with simple variant translocation and 5 cases (4.0% ) with complex variant translocation. 72.6% of Ph negative CML-BC had extra chromosomal abnormalities, with the most common ones being i(17q) and +14. 72.3% of Ph positive CML-BC had extra cytogenetic changes and +Ph, +8, i(17q) were the most frequent. The average time between diagnosis and blast crisis was 29.0 months (range 2 to 66 months) for Ph negative cases and 34.2 months (range 1 to 127 months) for Ph positive cases. 5 cases (5/28,17.9%) with der(9) deletions were detected by FISH technique. It is concluded that extra chromosomal abnormalities are common in CML-BC patients and FISH can effectively detect the der(9) deletions.
key wordschronic myeloid leukemia; CML-BC; karyotype analysis; derivative chromosome 9 deletion
慢性髓细胞白血病（CML） 是一种起源于多能造血干细胞的血液系统恶性疾病，占白血病总数的15%-25%，Ph染色体被认为是CML的特异性标志。在临床上患者一般在确诊2-5年内由慢性期进展到急变期（blast crisis, BC），慢性期时对化疗反应良好，进入急变期后化疗有效率不超过30%，生存期短，预后极差。CML病程中出现新的染色体异常克隆预示急变已得到广泛认可，进入急变期后附加染色体出现频率高、种类多，本研究对119例进入急变期的CML患者的核型进行了分析。
材料和方法
病例来源
119例CML-BC患者，其中男85例，女34例，男女比为2.5∶1，中位年龄40.6岁。CML诊断及分期标准参照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》（第二版）［1］。所有119例患者均行常规核型分析，其中随机选取28例标本作荧光原位杂交（FISH），以检测是否有衍生9号染色体［der(9)］缺失，取5例正常人骨髓作对照。
核型分析
119例患者中有5例在CML-BC期做了2次染色体检查，共有124例次核型资料，其中51例核型变化资料为定期复诊患者从初发病到急变及继续后的核型变化资料。在上述51例中4例急变后行异基因造血干细胞移植。全部病例均采用直接法及不加植物血凝素的短期培养法制备染色体标本，然后采用改良的热处理姬姆萨R显带技术分析20-40个分裂中期细胞核型，并参照《人类细胞遗传学国际命名体制［ISCN(1995)］》加以描述［2］。
荧光原位杂交
取出-20℃冰箱内保存的R 显带后细胞,换用新鲜的甲醇/冰醋酸（3∶1）固定液，气干法滴片，在普通光学显微镜下找到中期细胞。37℃ 2×SSC中老化30分钟，依次以70%、85%、100%的乙醇梯度脱水，每梯度2分钟。72℃甲酰胺中变性2分钟，再70%、85%、100%冰乙醇梯度脱水，每梯度2分钟，晾干。暗环境中取BCR-ABL双色双融合DNA易位探针1.0 μl(美国Vysis公司产品)、双蒸馏水2.0 μl、杂交稀释液7.0 μl于Eppendorf管中，离心、混匀，72℃水浴变性5分钟。每杂交区加10 μl上述反应液，盖上玻片并封胶4周。标本置于湿盒杂交16-18小时（37℃）。杂交后移去盖玻片，72℃ 0.3% triton/ 0.4×SSC洗液中洗2分钟，再于0.1% triton/2×SSC中洗1分钟。晾干后每杂交区加6 μl DAPI II，盖上玻片，暗盒中复染45-60分钟。Leica DMRA2荧光显微镜在DAPI/FITC/TexasRed三色滤光镜激发间期细胞荧光杂交信号：绿色荧光信号为BCR及（或）其断裂信号，桔红色荧光信号为ABL及（或）其断裂信号，黄色为融合信号。每例计数500个间期细胞，不计数重叠细胞。典型t(9;22)(q34;q11)为1红1绿2融合，其中期细胞可见Ph染色体及der(9)(9pter→9q34::22q11→22qter)上均有一个融合信号。对于间期细胞中仅有1个融合信号的标本，同时观察染色体分散较好、荧光信号清晰的10个中期细胞，以明确是否为der(9)(q34:: 22q11→22qter)缺失。
统计学处理
采用成组t检验和卡方检验。
结果
核型分析
Ph染色体的类型及频率124例次CML-BC中Ph阳性表达113例（91.1%），其中典型易位104例（83.9%），单纯变异易位4例（3.2%）（表1），复杂变异易位5例（4.0%）（表2），Ph阴性表达11例（8.9%），其中2例为正常核型（1.6%）。Table 1. Karyotype of 4 patients with simple variant translocation（略）Table 2. Karyotype of 5 patients with complex variant translocation（略）
附加染色体异常的类型及频率113例次Ph阳性CML-BC中82例（72.6%）伴有附加染色体异常，主要类型是： +Ph、+8、i(17q)；11例次Ph阴性CML-BC中8例（72.7%）伴有附加染色体异常，主要类型是： i(17q)、+14，两组比较无统计学差异（P＞0.05）。具体结果见表3。除此以外，出现2例次的附加异常有： -X、-Y、-2、+3、-5、+5q-、7p+、-7、+9、+9q+、+8p、+12、+12p+、-16、-18、Phq+；出现1次的附加染色体异CML随病程进展的核型变化本研究收集到51例患者从CML初诊到BC的核型演变资料。4例（7.8%）患者初诊时即为CML-BC，其中3例有附加染色体异常，1例为典型Ph易位。初诊为慢性期（CP）47例（92.2%），其中9例（19.1%）为典型易位，急变后核型不变，35例（74.5%）急变后出现附加染色体异常；2例（4.3%）初诊为正常核型，1例急变后核型不变，1例出现附加异常；1例（2.1%）初诊时即为复杂异常核型，急变后又出现了新的附加异常。与CP核型相比较，进入BC后出现附加染色体异常或出现新的附加染色体异常的病例共有37例，占78.7%，而核型保持不变的病例共为10例，占21.3%。5例在CML-BC做了2次染色体检查的病例中有3例（60%）第二次核型检查出现新的附加异常，2例核型不变。初诊时46例Ph阳性，包括单纯变异2例及复杂变异2例；除4例初诊时即为CML-BC，其余42例中27例（64.3%）急变后出现附加染色体异常。5例Ph阴性病例中3例（60%）急变后出现附加染色体异常。4例行异基因早血干细胞移植的患者均为CML-BC，3例出现附加染色体异常，1例为典型易位，移植后均转为正常供者核型。经非移植治疗的患者有8例（17.0%）骨髓象恢复CP，3例（37.5%）CML-BC时出现附加染色体异常，治疗后转为正常核型；4例（50%）CML-BC时出现附加异常，治疗后转为典型易位核型；1例（12.5%）CML-BC时为典型Ph易位核型；治疗后此克隆比例降低。Table 3. Type and frequency of extra chromosomal changes (略)
CML慢性期到急变期的时间
初诊为慢性期的病例，发生急变的时间最短为1月，最长为127月，平均33.0月。Ph阳性者急变时间为1-127月，平均34.2月；Ph阴性者急变时间为2-66月，平均29.0月，两组比较无统计学差异（P＞0.05）。初诊即发现附加染色体异常者6例，均为Ph染色体阳性，其中3例为CML-BC，另3例发生急变的时间分别为1月、1月、4月。
荧光原位杂交
对照组中间期细胞出现单个融合信号的百分率分别为0.4%、0.6%、1.0%、0.4%及0.8%，以大于对照组 +3SD作为阳性标准，将>1.4%的单个融合信号作为间期细胞单融合的标准。对照组中期细胞检测到der(9)缺失的细胞数目均为0，以大于对照组+3SD作为阳性标准，将≥1个中期细胞中检测到der(9)缺失确定为der(9)缺失（图1-A和图1-B）。按照以上标准，在28例随机选取的CML-BC病例中，有8例为间期细胞单融合阳性（图2-A），有5例（17.9%）确定为der(9)缺失，其中期细胞均观察到Ph染色体和der(9)缺失共同存在（图2-B），而这5例标本常规染色体检查均未发现der(9)缺失（表4）。5例der(9)缺失的病例中，3例出现附加染色体异常（60%）； 23例无der(9)缺失病例中13例出现附加染色体异常(56.5%)，两组比较无统计学差异（P＞0.05）。Table 4. Karyotype of 5 patients with derivative chromosome 9 deletions（略）
讨论
Ph染色体是CML恶性克隆特有的标记，已成为CML诊断、效果评价及预后判断的重要指标。Ph染色体出现在90%的CML中，5%-10%为变异易位［3］。本研究124例次CML-BC的Ph阳性比例及变异易位发生比例符合报道。目前将变异易位分为单纯性和复杂性，单纯变异易位定义为9号以外的任何一条染色体与22号之间的易位，复杂变异易位指涉及3条及以上的染色体的易位，其中22号必然累及，9号也常累及。但是随着荧光原位杂交技术的出现，越来越多的单纯变异易位病例中也发现有9号染色体参与，复杂变异易位也常涉及常规染色体分析难以发现的易位片段［3］，因此目前这种很多文献都采用的分类方法的准确性受到质疑。据文献报道，CML进入急变期后60%-80%的病例将出现附加染色体异常［4］，本组研究中Ph阳性和Ph阴性组发生附加染色体异常的比例分别为72.3%和72.6%，两组水平相当,无统计学差异（P＞0.05）。附加染色体异常发生可累及所有染色体，发生频率较高的依次为： +Ph（21.0%）、+8（17.7%）、i(17q)（13.7%）、+21（8.9%）、+19（8.1%）、+14（4.8%），除+8明显低于文献报道，其他顺序与频率与文献基本一致。虽然附加染色体异常发生可累及所有染色体，但相当一部分异常发生率极低，一般≤5%者考虑与化疗后染色体畸变有关，而非CML-BC特异性的改变。本研究中有30例（25.2%）的CML-BC出现2个及2个以上的异常克隆，且这些克隆之间明显呈干系与旁系的关系。本研究收集到的51例核型演变资料中, 78.7%的病例急变后出现附加染色体异常，而仅有21.3%急变后核型不变。进入BC后有60%的病例继续发生新的附加染色体异常，提示附加异常的发生与CML的疾病进展有密切联系。经非移植治疗后仅有17.0%的患者骨髓象恢复至慢性期,而这些患者的核型能得到不同程度的改善，提示非移植治疗CML-BC的效果较差，同时也可认为核型的改善与治疗效果直接相关。一般认为CML在确诊2-5年内由慢性期进展到急变期，本研究中47例患者平均发生急变的时间为33.0月, Ph阳性和Ph阴性组发生急变的平均时间分别为34.2月和29.0月,两组时间相当,无统计学差异（P＞0.05）。CML核型附加异常的出现通常比临床或血液学急变征象早出现2-4个月，本研究收集到的51例核型演变资料中初诊即存在附加染色体异常者6例，其中3例为CML-BC，另3例发生急变的时间均极短，分别为1月、1月和4月，因此病程中定期进行染色体检测对于发现急变有很大帮助。der(9)缺失在CML发病机制中的作用近年来逐渐引起关注。国外文献报道［5］，在CML中发生率为10%-15%，对于各临床分期中的发生率尚无大规模统计数据，国内未见相关报道。在本研究随机选取的28例CML-BC病例中，以FISH方法检测到5例（17.9%）存在der(9)的缺失。此5例的常规核型检查均未发现有der(9)的缺失，主要是因为缺失的片段较小，在普通光学显微镜下难以发现。本研究中选取的28例CML-BC病例均为典型t(9;22)易位,采用双色双融合探针，bcr和abl探针皆跨越基因断裂区域，当呈现1红1绿1融合的信号，再结合观察中期细胞，可认为abl区和bcr区均缺失。刘旭平等［6］报道，变异易位病例中abl区缺失时呈1红2绿1融合的信号，bcr区缺失时呈2红1绿1融合的信号。由于探针的特异性，并不能取代常规核型分析，因此在CML的诊断中将FISH技术与细胞遗传学检查结合具有十分重要的价值。在我们的研究中，间期细胞观察到8例单融合信号，结合中期细胞观察后仅有5例确定为der(9)缺失。除der(9)缺失外，间期细胞呈单融合信号的原因可能为：正常核型细胞红色与绿色信号重叠、部分杂交不良导致计数误差或Ph染色体缺失，因此诊断时必须结合中期分裂相中染色体形态。另外，CML-BC发生+Ph的机率较高，在观察到双融合信号时也需观察中期细胞以防产生假阴性结果，一般结合常规核型检查不难鉴别。已有研究表明der(9)的缺失是CML预后不良的独立因素［7］，常规化疗及移植疗效不佳，而用STI571可取得更好的治疗效果［5］。因此，CML初诊或进入急变期时检测是否存在der(9)的缺失对治疗方案的选择有指导意义。
【参考文献】
1 张之南，沈悌主编. 血液病诊疗及疗效标准. 第2版，北京: 出版社,1998：220-223
2 Mitelman F. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Basel: ISCN, 1995
3 Naumann S, Decker HJ. Genesis of variant Philadelphia chromosome translocations in chronic myelocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet, 2003; 147:18-22
4 Johansson B, Fioretos T, Mitelman F. Cytogenetic and molecular genetic evolution of chronic myeloid leukemia. Acta Haematol, 2002; 107:76-94
5 Quintas-Cardama A, Kantarjian H, Talpaz M, et al. Imatinib mesylate therapy may overcome the poor prognostic significance of deletions of derivative chromosome 9 in patients with chronic myelogenous leukem. Blood, 2005; 105:2281-2286
6 刘旭平,刘世和,李承文等. 慢性粒细胞白血病患者Ph染色体变异易位的细胞遗传学特征与荧光原位杂交研究. 实验血液学杂志，2004; 12:298-303
7 Morel F, Ka C, Le Bris MJ, et al. Deletion of the 5'ABL region in Philadelphia chromosome positive chronic myeloid leukemia: frequency, origin and prognosis. Leuk Lymphoma, 2003; 44:1333-1338
基金项目：江苏省135医学重点人才基金资助项目，编号 RC2002044
