多种化疗药对凋亡抑制蛋白Survivin在HL-60细胞中表达的影响
作者：吴耀辉，邹萍，刘芳，张敏，陈建华
【摘要】 Survivin基因是细胞凋亡抑制蛋白家族的新成员，由于其具有在人类正常组织不表达而在各种肿瘤组织高表达的特性，因此有望成为肿瘤的选择性靶点；有研究还表明survivin的表达与耐药性的发生有关。本研究旨在通过查明HL-60细胞在多种化疗药物作用后mRNA和蛋白的改变，初步探讨survivin和耐药性之间的关系。用合适浓度的柔红霉素(DNR)、米托蒽醌(MIT)和三氧化二砷(As2O3)作用于HL-60细胞，随后用RT-PCR检测给药的第1天和第3天HL-60细胞中survivin mRNA的表达情况，用Western blot检测survivin蛋白的表达情况。结果表明：在给予化疗药的第1天3组HL-60细胞中survivin mRNA表达水平全部降低，其中DNR组下降了10%，MIT组下降40%(P<0.01)，As2O3组下降了25%(P<0.01)。在给予化疗药的第3天，DNR和MIT组的HL-60细胞中survivin mRNA表达较第1天有明显的升高，分别上升20%(P<0.05)和65%(P<0.01)；但给予As2O3组中的survivin mRNA表达仍持续降低，仅为第1天的68%(P<0.01)。Western blot检测发现，给予DNR和MIT 3天后的HL-60细胞中survivin蛋白含量分别升高了14%和11%，而给予As2O3组则下降了82%。结论：在给予化疗药后白血病细胞survivin表达先降低后升高的现象可能与化疗中耐药性的发生有关，而三氧化二砷有着不同的作用机制，这在逆转耐药性上可能发挥重要的作用。
【关键词】 柔红霉素
Alteration of Expression of Survivin in HL-60 Cells Treated with Chemotherapeutic Drugs
Abstract Survivin，a new member of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family，expressed in the most human cancers but not in terminally differentiated adult tissues，so survivin may be a target for tumor therapy.In addition，some scholars found that survivin expression is associated with the resistance in chemotherapy. To explore the relationship between survivin and drug-resistance，the alteration of survivin mRNA and protein of HL-60 cells treated with daunomycin (DNR)，mitoxantrone (MIT) and arsenic trioxide (As2O3) was investigated，the expressions of survivin mRNA and survivin protein were detected on the first and third day by RT-PCR and Western blot，respectively.The results showed that survivin mRNA levels all decreased after the first day of treatment with drugs.It was decreased by 10% in DNR group，40% (P<0.01) in MIT group，and 25% (P<0.01) in As2O3 group in comparison with control cells.In the third day，the survivin mRNA treated with DNR was up-regulated by 20% (P<0.05)，compared with the first day，and MIT was up-regulated by 65% (P<0.01)，but As2O3 was still down-regulated by 32% (P<0.01).In Western blot，survivin protein level increased 14% after treated with DNR for three days，compared with the control cells，and 11% in MIT，but decreased by 82% in As2O3.It is concluded that after treatment with chemotherapeutic drugs，the survivin level descended at first day and then ascended obviously.This phenomenon may be associated with the resistance in chemotherapy for leukemia.On the other hand，As2O3 shows a different mechanism that may play a significant role to reverse resistance.
Key words daunomycin; mitoxantrone; arsenic trioxide; survivin; HL-60 cell
细胞凋亡受阻在肿瘤的发生、及肿瘤化疗耐药等方面占有重要的地位。近年来的研究表明，细胞凋亡调节的改变可能是肿瘤化疗耐药发生的原因之一［1］。Survivin作为细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员，由于其具有在人类正常组织不表达，而在人类各种肿瘤组织高表达的特性［2］，有望成为肿瘤治疗的选择性靶点，引起了学者们的广泛关注。化疗在目前仍然是治疗白血病的主要方法，但日益增多的耐药性的出现严重影响了治疗的疗效，而耐药性发生机制目前尚不十分清楚。我们通过研究多种化疗药物作用人急性髓性白血病细胞系HL-60后survivin mRNA和蛋白的变化，初步探讨survivin和化疗耐药性之间的关系。
材料和方法
材料与试剂
RPMI 1640培养液、新生牛血清、TRIZOL试剂购自Gibco公司，MMLV逆转录酶、RNA抑制物为Promega公司产品，DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司，兔抗人survivin多克隆抗体为Santa Cruz公司产品，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自北京中山生物工程公司，β-actin和survivin的引物由上海生物工程公司合成，人急性髓性白血病细胞株HL-60由华中科技大学同济医学院免疫教研室惠赠，柔红霉素(daunomycin，DNR)为法玛西亚普强有限公司产品，米托蒽醌(mitoxantrone，MIT)购自四川升和制药，三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)为哈尔滨伊达制药厂产品。
细胞培养
人急性髓系白血病细胞HL-60以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃ 5% CO2条件下培养。取对数生长期HL-60细胞，按2×105/ml的浓度接种于6孔板，每孔5 ml，实验分为柔红霉素(20 ng/ml)、米托蒽醌(5 ng/ml)和三氧化二砷(1 μmol/L)及不加药HL-604组，分别于加药培养后第1和第3天收集细胞备用。
逆转录聚合酶链反应( RT-PCR )检测
采用RT-PCR技术分别检测给药和不给药细胞中survivin mRNA的表达。人survivin的PCR引物为5＇-CTCAAGGACCACCGCATCTC-3＇和5＇-CCTCAATCCATGGCAGCCAG-3＇，合成产物392 bp; β-actin为内参照，引物5＇-TGTACGTTGCTATCCAGGCT-3＇和5＇-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3＇，合成产物247 bp。
RT-PCR采取二步法。用TRIZOL试剂提取细胞的总RNA，紫外分光光度计检测其浓度(浓度的公式为：样品的A260值×40×稀释倍数，单位是μg/ml)和纯度(样品的A260/A280比值)，逆转录生成cDNA。PCR的总反应体系为50 μl，其中包括cDNA 3 μl，10×PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 10 μl，10 mmol/L dNTP 1.5 μl，Taq酶2 U，survivin 上、下游引物各25 pmol，β-actin上、下游引物各25 pmol 。反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃复性45秒，72℃延伸1分钟，循环30次，最后72℃再延伸10分钟。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察、摄像，分析结果。试验重复3次，结果取平均值。
Western blot分析
将预冷至4℃的裂解缓冲液加入到经PBS漂洗的第3天收集的培养细胞中，冰上作用20分钟，12 000×g离心2分钟后，上清液保存于－20℃；测定蛋白质浓度，上样，SDS－PAGE凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，在含5%脱脂奶粉的TTBS中37℃封闭90分钟，加入一抗(兔抗人survivin多克隆抗体，稀释度为1∶1 000)，4℃孵育过夜，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，稀释度为1∶1 000)，37℃作用40分钟，化学荧光法(ECL)显色，观察结果。
统计学分析
采用SPSS 10.0软件进行数据处理，各组间比较采用方差分析，两两比较采用t检验。
结 果
Survivin基因在HL-60细胞中的表达
RT-PCR检测显示，与未加药的HL-60细胞相比，给予3种化疗药物作用1天后的HL-60细胞中survivin表达全部降低，其中柔红霉素组中下降约10%，三氧化二砷组中下降25%(P<0.01)，米托蒽醌组中下降40%(P<0.01)；在第3天，柔红霉素组和米托蒽醌组的HL-60细胞中survivin表达较第1天明显升高，分别升高了20%(P<0.05)和65%(P<0.01)，但给与三氧化二砷组的HL-60细胞中survivin表达仍持续降低，约为第1天表达量的68%(P<0.01)(附表、图1)。由此可见，给予柔红霉素和米托蒽醌后，HL-60细胞中survivin mRNA表达先表现为降低，但随着时间的延长其表达又逐渐升高，而三氧化二砷则能使HL-60细胞中survivin的含量持续降低。Table. Expression of the survivin in HL-60 cells after treating with three kinds of chemotherapeutic drugs（略）
Survivin蛋白的表达
应用Western blot检测Survivin蛋白的表达显示，处理1天后4组细胞survivin蛋白的含量大致相同，无明显区别。第3天，可见HL-60＋DNR组和HL-60＋MIT组比对照组survivin蛋白含量分别升高了14%和11%，而HL-60＋As2O3组则明显降低，仅约为对照组的18%(图2)。由此可见，DNR和MIT能使HL-60细胞中survivin蛋白含量升高，但As2O3则会使survivin明显降低。
讨 论
白血病是血液系统患者死亡率很高的一种疾病，患者5年生存率很低，化疗耐药是影响其疗效的主要原因之一。因此，克服肿瘤化疗耐药成为白血病的关键。传统认为，白血病化疗耐药的机制可能包括药物代谢途径改变、药物作用靶目标修饰、DNA修复率上升、药物诱导DNA损伤下降等。近年来研究表明，细胞凋亡调节的改变可能是肿瘤化疗耐药的原因之一［1］。Survivin是1997年发现的IAP家族新成员之一，Survivin广泛表达于各种肿瘤组织中，而在正常组织不表达［2］。Carter等［3］用RT－PCR的方法检测18例AML（含AML的各种类型）患者，发现有16例患者表现为不同程度的survivin阳性。Adida等［4］同样发现在125例AML患者中，有75例检测到survivin mRNA的表达，其阳性率高达60%。上述研究表明survivin与白血病有一定的关系。
最近，国内外的研究均表明survivin的表达和肿瘤化疗耐药性有着密切的关系。有人报道，给与顺铂后胃癌细胞系MKN-45的survivin mRNA和蛋白的含量增加2-6倍［5］。国内也有学者发现，在肝癌细胞株HepG2 中加入低浓度的5-FU后survivin mRNA和蛋白的表达量分别增高3.9和4.1倍［6］。在本实验中，我们以MTT筛选出的3种化疗药的合适浓度作用于HL-60细胞(数据另文报道)，发现给予DNR和MIT 1天后HL-60细胞survivin表达降低，与以上学者的报道略有差异，但到了第3天，survivin的表达量较第1天有了明显上升。由此可见，白血病细胞在刚开始时自身表达survivin，对柔红霉素、米托蒽醌等化疗药敏感，化疗药可以通过降低survivin的表达而引起细胞凋亡，但随着时间的延长，存活的白血病细胞中survivin的表达量增加，抗凋亡能力增强，从而对化疗药物产生耐药性。这种现象也符合临床白血病患者化疗时对化疗药物先敏感后耐药的一般。另外，在本实验中As2O3组HL-60细胞中survivin的表达量持续降低，与DNR组和MIT组表现不同，分析原因可能与3种药物作用机制不同有关。柔红霉素和米托蒽醌主要作用于细胞的核酸合成过程，能直接与DNA结合，阻碍DNA合成和依赖DNA的RNA合成反应，而As2O3则是通过PML位点降解PML-RARα融合蛋白诱导白血病细胞凋亡，同时小剂量三氧化二砷也可以诱导白血病细胞的分化成熟。Yong等［7］报道，0.1-1 μmol/L As2O3在标准条件下6天可以诱导20%-30%的急性早幼粒细胞分化。在本实验中As2O3的工作浓度为1 μmol/L，这个浓度对HL-60细胞主要起诱导分化作用，从而使survivin的表达持续降低。这也能较好的解释临床上一些对很多化疗药疗效欠佳的白血病病人采取三氧化二砷治疗后获得较好疗效的现象。此外，三氧化二砷能持续降低survivin表达的现象提示我们，三氧化二砷联合其他化疗药治疗白血病可能会有利于降低耐药性的发生，而取得更佳的疗效。
虽然survivin抑制化疗药在内的各种刺激因素所引起的细胞凋亡机制还不清楚，但目前研究认为，可能是通过多种途径实现的： ① survivin能与激活的caspase-3和capase-7结合，阻止由caspase激活剂或凋亡诱导剂诱导的细胞DEVD-Cleaving自杀酶的积累从而阻止细胞凋亡［8］； ② survivin还可能与化疗时肿瘤细胞释放的第二个线粒体起源的caspase激活剂(Smac/DIABLO)结合，从而阻断后者对细胞凋亡蛋白抑制剂的结合，进而抑制细胞凋亡［9］； ③ survivin还可以介导血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤血管生成中的抗细胞凋亡作用［10］等等。
总之，鉴于survivin在化疗耐药中的重要作用，应进一步了解其机制，以实现将来以survivin为靶点的治疗，减少耐药性的发生，提高肿瘤的治愈率。
【】
1Liu JR，Opipari AW，Tan L，et al.Dysfunctional apoptosome activation in ovarian cancer: implications for chemoresistance.Cancer Res，2002; 62: 924-931
2Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma.Nat Med，1997; 3: 917-921
3Carter BZ，Milella M，Altieri DC，et al.Cytokine-regulated expression of survivin in myeloid leukemia.Blood，2001; 97: 2784-2790
4Adida C，Recher C，Raffoux E，et al.Expression and prognostic significance of survivin in de novo acute myeloid leukemia.Br J Haematol，2000; 111: 196-203
5Ikeguchi M，Liu J，Kaibara N.Expression of survivin mRNA and protein in gastric cancer cell line (MKN-45) during cisplatin treatment.Apoptosis，2002; 7: 23-29
6罗顺峰，朱红，张万广等.5-Fu对肝癌细胞内凋亡抑制蛋白survivin的诱导作用. 肝胆外科杂志，2002; 10: 227-228
7Jing Y，Wang L，Xia L，et al.Combined effect of all-trans retinoic acid and arsenic trioxide in acute promyeliocytic leukemia cells in vitro and in vivo.Blood，2001; 97: 264-269
8Tamm I，Wang Y，Sausville E，et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptotic induced by Fas(CD95)，Bax，caspase and anticancer drugs.Cancer Res，1998; 58: 5315-5320
9Song Z，Yao X，Wu M.Direct interaction between survivin and Smac/DIABLO is essential for the anti-apoptotic activity of survivin during taxol-induced apoptosis.J Biol Chem，2003; 278: 23130-23140
10Mesri M，Morales-Ruiz M，Ackermann EJ，et al.Suppression of vascular endothelial growth factor-mediated endothelial cell protection by survivin targeting.Am J Pathol，2001; 158: 1757-1765
