人AGM区基质细胞对脐血LTC-IC的支持作用
【摘要】 为探讨人主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞对脐血长期培养启动细胞（LTC-IC）的造血支持作用，建立了人AGM区基质细胞与脐血CD34+细胞体外长期共培养体系。采用免疫磁珠方法分离人脐血CD34+细胞，接种于已制备好人AGM区基质细胞（hAGMS1-S5）饲养层的24孔板中共培养，同时设无饲养层组作为对照，分别于共培养5、6、7、8周时收获细胞行造血细胞集落培养，并采用极限稀释法（LDA）检测与人AGM区基质细胞共培养后的脐血CD34＋ 细胞的LTC-IC含量。结果表明，无饲养层的对照组培养5周后不再产生造血细胞集落，而以hAGMS1-S5作为饲养层，共培养5周后造血细胞仍具有集落形成能力。hAGMS1-S5维持LTC-IC的作用组间比较有显著性差异（P<0.05），其中以hAGMS3与S4组支持作用最强。LDA检测结果显示，hAGMS3和S4维持LTC-IC的能力无显著性差异（P>0.05）；与hAGMS3和S4共培养14天后脐血CD34＋ 细胞中的LTC-IC扩增，分别是达到(176±46)%、(187±52)%，S3和S4两组间比较无显著性差异（P>0.05）。结论：人AGM区基质细胞S1-S5对脐血LTC-IC具有维持作用，特别是hAGMS3和S4两株细胞对脐血LTC-IC具有更好的维持及扩增作用。
【关键词】 AGM区
Supportive Effects of Human Aorta-Gonad-Mesonephros-Derived Stromal Cells on Umbilical Cord blood LTC-IC
Abstract The objective of this study was to explore the supportive effects of human aorta-gonad-mesonephros(AGM)-derived stromal cells on human umbilical cord blood long-term culture-initiating cells (LTC-IC). A co-culture system was established with human AGM stromal cells and umbilical cord blood CD34+ cells. Different stromal cells derived from human AGM region (hAGM S1-S5) were plated on 24-well plates as feeder cells. CD34+ cells were positively selected from human umbilical cord blood through immunomagnetic bead selection method，seeded on the feeder cells，and co-cultured for 8 weeks. The hematopoietic cells were collected at 5，6，7 and 8 weeks for CFC analysis. Frequencies of LTC-IC in umbilical cord blood CD34+ cells after co-culture with AGM stromal cells were detected through limiting dilute analysis(LDA). The results showed that there was no any hematopoietic CFC in the feeder cell-free culture system after 5 weeks of co-culture. However，in AGM feeder cells culture systems，there were still CFCs after 5 weeks of co-culture，which indicated that human AGM stromal cells could maintain LTC-IC in vitro. In groups of hAGM feeders，hAGMS3 and S4 had better supportive effects than other AGM groups (P<0.05). The absolute number of LTC-IC in hAGM S3 and S4 culture systems got expansion up to (176±46)% and (187±52)% respectively without significant difference between hAGMS3 and S4 (P>0.05). It is concluded that human AGM stromal cells S1-S5 support the maintenance of umbilical blood LTC-IC in vitro，while hAGMS3 and S4 cells have better effects on maintaining LTC-IC and expansion of LTC-IC.
Key words AGM region；stromal cell；LTC-IC；cord blood
主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros，AGM）区是胚胎期永久造血的起源部位，正成为国际上造血发生、分化机理研究中的热点。AGM区造血微环境对多能造血干细胞的发生及发育起重要作用。基质细胞是造血微环境的主要成分，通过研究基质细胞的体外造血支持功能是分析造血微环境的重要途径。本研究探讨人AGM区基质细胞对人脐血来源的长期培养启动细胞（long-term cultur-initiating cell，LTC-IC）的造血支持作用，为阐明AGM
区基质细胞在胚胎造血发生中的作用提供理论和实验依据。
材料和方法
主要试剂
CD34＋MidiMACS细胞磁珠分离系统购自德国Miltenyi Biotec公司；荧光标志小鼠抗人抗体CD34-FITC购自PharMingin公司；造血细胞长期培养基MethoCultTM H5100及造血祖细胞集落培养基MethoCultTM GF+ H4435购自Stem Cell Technologies；胰蛋白酶购自Gibco BRL公司；Hydrocortisone及丝裂霉素C购自Sigma公司。
人AGM区基质细胞饲养层的制备
按本室方法，已建立 5 株人 AGM 区基质细胞系，命名为 hAGMS1-S5［1］。分别取第 5-6 代的hAGMS1-S5细胞，接种至24孔板和96孔板，细胞融合达80％-90％时予丝裂霉素C（浓度10 μg/ml）处理2小时，PBS洗3次后加基质细胞培养基，置于37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中备用。
脐血的采集和CD34+ 细胞的分离富集
采集本院产房出生的正常足月新生儿的脐血，共5份。按常规方法分离得到脐血单个核细胞后，按照CD34+ 细胞分选试剂盒说明，采用免疫磁珠法进行CD34+ 细胞的分离富集。用抗CD34-FITC标记后通过流式细胞仪检测CD34+ 细胞百分率。
人AGM区基质细胞对脐血LTC-IC的支持作用
根据培养体系中饲养层的种类不同分为6组，即hAGMS1-S5饲养层组及无饲养层的对照组。将脐血CD34+ 细胞按2.0×104/孔接种于制备好饲养层的24孔板中，每孔培养体系1 ml，培养基为含1 μmol/L 氢化可的松的造血细胞长期培养基H5100（其成分为α-MEM含12.5％胎牛血清、12.5％马血清、10 μmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.2 mmol/L i-肌醇、16 μmol/L 叶酸），置于37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中进行长期培养，每3-4天半量换液1次，分别于培养5、6、7、8周时每组各取2孔收获细胞，其方法如下：收获无饲养层支持的细胞时，将所有的悬浮细胞吸出即可。收获有饲养层支持的细胞时，先将悬浮的非贴壁细胞吸出之后，用0.25%胰蛋白酶将贴壁层消化，使之脱壁并吹打成单细胞悬液，悬浮于H5100培养基，置于6孔板中，37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中培养1小时，收获上层的非贴壁细胞，此作为黏附于饲养层细胞的非贴壁细胞，与首次吸出的非贴壁细胞混合，即为收获的共培养后造血细胞。采用H4435集落培养液(其成分为IMDM中含1.0％甲基纤维素，30％胎牛血清，1％BSA，10-4mol/L 2-巯基乙醇，2 mmol/ L-谷胺酰氨，50 ng/ml rh SCF，20 ng/ml rhGM-CSF，20 ng/ml rh IL-3，20 ng/ml rhIL-6，20 ng/ml rhG-CSF，3 U/ml rhEPO)对收获的细胞进行集落培养，14天时在倒置显微镜下计数，≥40个细胞为1个集落。
极限稀释法（limiting dilution analysis，LDA）检测LTC-IC频率
将与hAGMS3、S4细胞共培养0天的脐血CD34+ 细胞按20、60、120、300、600的细胞密度及将与hAGMS3、S4细胞共培养14天的脐血CD34+ 细胞按100、 500、 1 000、 1 500、 3 000的细胞密度，接种到已制备好的 AGM 区基质细胞铺底的 96 孔板，24孔/剂量，每孔培养体系为200 μl，培养液为含1 μmol/L氢化可的松的H5100，置于37℃、5％ CO2饱和湿度培养箱中培养，每周半量换液1次。至第5周时，用集落培养基H4435继续培养14天，计数有集落形成的孔数。使用L-CalcTM version 1.1软件统计LTC-IC频率。LTC-IC的绝对数用共培养0天、14天测得的单个核细胞总数分别与相应的LTC-IC频率相乘。
统计学处理
计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS 10.0统计软件包处理，两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05被认为有统计学意义。
结 果
脐血CD34＋ 细胞的分离富集
共采集5份脐血，体积为70-100 ml，单个核细胞总数（2.32-5.58）×108，用MACS系统可获得（2.50-3.42）×106个CD34＋ 细胞，经流式细胞术检测，其富集为86.75％-92.35％。
人AGM区基质细胞对脐血LTC-IC的支持作用
将脐血CD34＋ 细胞在hAGM区基质细胞S1-S5饲养层上进行长期培养。结果显示，无饲养层的空白对照组培养5周后不再产生造血细胞集落，基质细胞作为饲养层在LTC-IC的培养中是一个重要的条件，以hAGMS1-S5作为饲养层，共培养5周之后造血细胞仍具有集落形成能力，表明人AGM区基质细胞具有维持LTC-IC的能力。hAGMS1-S5细胞维持LTC-IC的作用组间比较也有显著性差异（P<0.05），其中以hAGMS3与S4组支持作用最强（附表）。Table. Effect of human AGM stromal cells on cord blood LTC-IC at and after 5 weeks in culture (略)
人AGM区基质细胞对脐血LTC-IC的扩增作用
在证实人AGM区基质细胞可支持LTC-IC的基础上，本研究应用极限稀释法进一步检测与人AGM区基质细胞共培养后的脐血CD34＋ 细胞的LTC-IC含量。结果显示，以hAGMS3、S4为饲养层，共培养0天时新分选的脐血CD34＋ 细胞中含有的LTC-IC频率分别为1/187(1/168-1/207)、1/180(1/162-1/200)，hAGMS3、S4两株细胞维持LTC-IC的能力无显著性差异（P>0.05）。与hAGMS3、S4基质细胞共培养14天后的脐血CD34＋ 细胞中的LTC-IC频率分别为1/2523(1/2250-1/2828)、1/2020(1/1813-1/2249)，其频率分别与相应的细胞总数相乘，LTC-IC绝对数分别扩增(176±46)%、(187±52)%，hAGMS3、S4对LTC-IC的扩增倍数无显著性差异（P>0.05）。
讨 论
AGM区是胚胎造血发生原点，也是胚内最早出现多能造血干细胞的组织区域［2-5］。在孕期30-37天的人胚胎中约有800个CD34＋的造血干细胞聚集在上肢芽水平的背主动脉中［6，7］。由于AGM区是永久造血干细胞的最早产生部位，推测AGM区存在利于造血干细胞发生及维持其干细胞性的造血微环境。但迄今为止，人们对AGM区微环境在造血干细胞发生发育中的具体作用机制，即AGM区通过何种机制吸引造血干细胞在此处定殖、扩增并最终发育成功能完善的永久造血干细胞的分子机制仍不清楚。阐明其中的机制对造血干细胞的体外培养及相关造血干细胞工程研究均有重要意义。
基质细胞是构成造血微环境的主要成分，具有重要的研究价值。1998年Xu等［8］从孕10.5天小鼠胚胎中分离出AGM区组织，建立了AGM区基质细胞系，发现以小鼠AGM区基质细胞作饲养层，在不加造血生长因子的情况下与人脐血CD34＋细胞共培养3周，造血祖细胞集落扩增了5.3倍，而且小鼠AGM区基质细胞不仅扩增CD34＋CD38＋细胞，对CD34＋CD38－细胞甚至更原始的Lin-c-Kit+Sca-1+细胞均有扩增作用。
LTC-IC是指在长期培养体系中培养5周后所测得的集落细胞，它是Sutherland等［9］在1990年利用Dexter建立的长期培养体系培养细胞时发现的。在分化发育水平上LTC-IC比HPP-CFU更原始。通过检测体外长期培养体系中基质细胞对LTC-IC的维持和扩增作用可评估基质细胞对原始造血干细胞的调控作用。
2002年Oostendorp等［10］分离11天小鼠胚胎的AGM区组织，亦建立了小鼠AGM区基质细胞系，并采用体外长期培养体系检测小鼠AGM区基质细胞对LTC-IC的维持能力，他们将骨髓造血细胞接种在小鼠AGM区基质细胞饲养层上，共培养4-5周后，收获细胞行造血集落培养，结果发现在53个小鼠AGM区基质细胞克隆中，约1/3的基质细胞克隆可维持LTC-IC的生长。但是，AGM区基质细胞在维持LTC-IC生长的基础上，是否可进一步对LTC-IC具有扩增作用，目前未见有关报道。
为检测人AGM区基质细胞对原始的造血干细胞的造血支持功能，本研究采用了两种方法来分别分析人AGM区基质细胞对LTC-IC的维持和扩增作用，即首先通过长期培养体系检测人AGM区基质细胞对LTC-IC的维持能力，然后通过极限稀释法检测其对LTC-IC的扩增作用。在长期培养过程中，为更好地观察人AGM区基质细胞的作用，避免其他因素干扰，本研究仅采用造血细胞长期培养基H5100，培养体系中未添加其它任何外源性造血生长因子。检测结果显示，脐血CD34+ 细胞在人AGM区基质细胞S1-S5饲养层上体外长期培养，培养5周、6周、7周造血细胞仍具有集落形成能力，尤其是以hAGMS3、S4 2株细胞作为饲养层，培养8周仍有少量集落形成，从而证实人AGM区基质细胞同样具有长期维持LTC-IC的能力。为进一步研究人AGM区基质细胞对LTC-IC的扩增作用，本研究以造血支持作用最为明显的hAGMS3、hAGMS4为饲养层，采用极限稀释法检测体外共培养14天后的脐血CD34+ 细胞中的LTC-IC的含量。检测结果显示，hAGMS3、hAGMS4饲养层组LTC-IC 扩增分别达到（176±46）%及（187±52）%，进一步证实人AGM区基质细胞作用于早期的原始造血干细胞，可维持其干性并对其有一定的扩增作用。
本研究证实人AGM区基质细胞（hAGMS1-S5）对脐血LTC-IC具有维持作用，特别是hAGMS3、S4两株细胞对脐血LTC-IC具有更好的造血干性维持及适度的扩增作用，为胚胎早期造血发生机制研究提供了重要的模式细胞和基础资料。
【】
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