HLA新等位基因A*3018的序列分析和确认
作者：李桢， 邹红岩， 邵超鹏， 孙革， 金士正， 程良红
【摘要】 为了识别和确认汉族人群中的HLA新等位基因， 使用PCR?SSP、FLOW?SSO以及PCR?SBT等HLA分型技术，发现样本A位点的杂合结果A*240201，300101在外显子2有3个位置与数据库不相符。用组特异性引物分别扩增A*24及A*30基因，对外显子2、3、4进行双向测序，发现1个与A*300101序列相近的新等位基因。分析该等位基因与A*300101序列的差异。用EB病毒感染外周血B淋巴细胞，建立该等位基因的无限增殖化B淋巴细胞系。结果表明： 该基因与A*300101相比在外显子2有3个碱基的改变，碱基121A→C、 123T→C导致密码子17 AGT ?> CGC, 17S（丝氨酸）→R（精氨酸）；碱基126A→G导致密码子18 GGA →GGG，18G（甘氨酸）→G（甘氨酸），该氨基酸是同义突变。成功建立了该等位基因的无限增殖化B淋巴细胞系，该基因序列已提交GenBank，编号为DQ872509。 结论： 该等位基因为新的HLA?A等位基因，已于2006年8月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA?A*3018（上报编号HWS10004039）。
【关键词】 人类白细胞抗原
Identification and Sequence Analysis of A Novel HLA?A*3018 Allele
Abstract To identify HLA novel allele in Chinese Han individuals, an unknown HLA?A allele was detected by PCR?SSP and FLOW?SSO in Chinese Han individuals. Heterozygous sequence?based typing(SBT) showed that there were 3 differences compared with database in exon 2. Its anomalous patterns suggested the possible presence of either a novel A*30 or a novel A*24. To separate the two alleles and to determine whether the allele is novel, the HLA?A*30 and HLA?A*24 alleles were amplified separately by using a commercial kit for the single allele?specific sequencing strategy, and both alleles for exons 2?4 were sequenced according to the manufacturer' protocol. To prepare B?lymphoblastoid cell line of the novel HLA allele by using Epstein?Barr virus?infected B?lymphoblastoid cells in the peripheral blood. The results indicated that the sequencing results showed HLA?A alleles of the sample to be HLA?A*240201 and a new A*30 allele. The sequences of the new A*30 were identical to those of HLA?A*300101 except for three nucleotide changes in exon 2: at nt 121(A→C), nt 123(T→C) and nt 126(A→G), resulting in an amino acid residue substitution from S(AGT) to R(CGC) at codon 17 and a synonymous substitution from G(GGA) to G(GGG) at codon 18. Immortalized B?lymphoblastoid cell line of the novel HLA?A*3018 allele was achieved, the sequence of HLA?A*3018 allele was submitted to GenBank and its accession number was DQ872509. In conclosion, the HLA?A*3018 is a novel HLA?A allele and has been officially named HLA?A*3018 by the WHO Nomenclature committee in August 2006（HWS10004039）.
Key words HLA; HLA?A allele; HLA?A*3018; sequence analysis
人类白细胞抗原（HLA）系统在遗传学、法医学和移植免疫中起着非常重要的作用。近几年来，随着分子生物学的及测序技术的推广，HLA新等位基因不断被发现。截止目前，人类白细胞抗原的A位点已有450个基因，A*30组已发现20个等位基因［1］。我们在常规工作中发现一份标本，PCR?SSP分型结果A位点为A*24，?， FLOW?SSO分型结果为A*24，30，即两种试剂出现了不同的分型结果。杂合测序显示HLA? A*240201，300101的杂合结果在外显子2有3个碱基与数据库（IMGT/HLA release 2.13, April 2006）不相符。我们用组特异性引物分别扩增了A*24及A*30基因，对其分别进行外显子2、3、4的双向测序，发现一个与A*300101序列相近的新等位基因，其血清学特异性有待进一步确认。该基因被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA?A*3018。此样本的HLA分型结果为A*3018/A*240201, B*1301/B*
材料和方法
样本来源
中华造血干细胞捐献者资料库志愿捐献者，男性，汉族，籍贯河南。家系调查采集先证者父母的血样。随机抽选本中心500名造血干细胞捐献者进行基因频率调查。
DNA快速提取试剂盒由美国Gentra公司提供。HLA低分辨率基因分型试剂由美国G&T公司（试剂批号 Lot RF08）以及美国One?Lambda公司（试剂批号HLA?A Lot 007）提供。高分辨率基因分型试剂中杂合测序试剂盒使用Atria Genetics AlleleSEQR HLA?B SBT Pack（Atria Genetics, South San Francisco, CA ）；单基因扩增测序使用Protrans S4 HLA?A single allele?specific sequencing set（Protrans GmbH, Ketsch, Germany）。淋巴细胞分离液由上海恒信试剂厂提供。RPMI 1640培养液为Sigma公司产品。A*3018序列特异性引物合成及PCR所需试剂由大连宝生物公司提供。
主要仪器
9700 PCR 扩增仪（PE公司产品），电泳仪（美国Embi公司产品），流式磁珠分析仪（Luminex 100液相分析平台），3100测序仪（Applied Biosystems公司产品），CO2培养箱（德国Heraeus BBD6220型）。
HLA分型及序列分析
使用5% EDTA抗凝外周全血，取300 μl用DNA快速提取试剂盒提取DNA。HLA低分辨率分型采用了PCR?SSP以及FLOW?SSO两种方法。高分辨率分型先使用了Atria Genetics AlleleSEQR HLA?B SBT Pack进行杂合测序，分析软件使用Assign version 3.5 20060714版本(Conexio Genomics, Applecross, Western Australia, Australia)，最后使用Protrans S4 HLA?A single allele?specific sequencing set分别扩增A*24及A*30基因，并对外显子2、3、4进行双向测序，从而确认突变基因。分析软件使用Sequence pilot 2.2 版本 (Protrans GmbH)。
HLA?A*3018等位基因的PCR?SSP鉴定
设计序列特异性引物见表1。采用双管PCR特异性扩增A*3018等位基因。该两对引物扩增结果均阳性即为A*3018等位基因。PCR扩增反应体系为25 μl，其中10×PCR缓冲液2.5 μl，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，dNTP终浓度0.4 mmol/L，引物终浓度0.25 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，DNA 80 ng。扩增条件为94℃预变性1分钟，94℃变性30秒、58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后1循环72℃延伸5分钟后冷却至4℃。取扩增后标本10 μl，置于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳。
细胞株的建立
采集外周血，用PBS对半稀释，按血与淋巴细胞分离液（上海恒信试剂厂）=2∶1比例，小心地将血液加至分离液上层，400×g，离心20分钟；取白膜层，加8 ml PBS洗涤，250×g，离心5分钟，弃上清；用无血清RPMI 1640培养液洗涤，计数，然后250×g离心5分钟弃上清。按2×106个细胞/1 ml EBV液将细胞混匀，37℃、5% CO2放置2-3小时，然后250×g离心10分钟去病毒。按1×106个细胞/毫升加入含20% FBS、2 μg/ml CsA的RPMI 1640培养液，于24孔板中，在37℃、 5% CO2条件下培养，7天后换半液，以后3天换液1次，多个增殖灶形成后换瓶培养，将CsA减半，细胞呈对数增长后去除CsA。
结 果
低分辨率分型中G&T公司试剂PCR?SSP分型结果： A位点为A*24，?，未检测出A*30基因。凝胶电泳图见图1，电泳加样顺序见表2。在复检样本时发现FLOW?SSO分型结果为A*24，30，未出现异常格局。两种试剂出现了不同的分型结果。
Atria Genetics AlleleSEQR HLA?B SBT Pack试剂盒测序显示，HLA? A*240201，300101的杂合结果在外显子2有3个碱基位置（碱基121、 123、 126）与数据库（IMGT/HLA release 2.13, April 2006）不相符，杂合测序结果图见图2。
使用Protrans S4 HLA?A single allele?specific sequencing set分别扩增A*24及A*30基因后，分别对其外显子2、3、4进行了双向测序，发现等位基因A*240201没有碱基变异。该未知基因与其最相近的HLA? A*300101相比，在exon2有3个碱基不同，碱基121A→C、 123T→C导致密码子17 AGT → CGC, 17S（丝氨酸）→R（精氨酸）；碱基126A→G导致密码子18 GGA →GGG，18G（甘氨酸）→G（甘氨酸），该氨基酸是同义突变。3个突变点与杂合测序结果所测位置相符。突变碱基及所致氨基酸改变见图3。
Figure 2. Results of heterozygous sequencing of HLA? A*240201，300101(three nucleotide changes in exon 2：121、 123、 126)
该新等位基因序列已被GenBank接受，编号为DQ872509。根据世界卫生组织（WHO） HLA因子命名委员会命名原则的要求，将新等位基因有关材料上报给WHO HLA因子命名委员会（上报编号HWS10004039），最终该基因于2006年8月被正式命名为HLA?A*3018。我们建立的PCR?SSP可以将A*3018和A位点其它的等位基因完全区分。在对500名随机造血干细胞捐献者的检测中，未发现其他带有A*3018基因的个体。
该家系的3个家庭成员HLA分型结果见图4（家系遗传图）。家系调查结果表明，先证者带有的A*3018基因系来自其父亲，携带该基因的HLA单倍型为A*3018，B*1301，DRB1*0701。
我们成功建立了HLA?A*3018等位基因的无限增殖化B淋巴细胞系，为今后更丰富的研究提供了可靠的实验材料。
讨 论
人类白细胞抗原（HLA）是至今所知人类最复杂的免疫遗传多态性系统，它在不同种族或同一种族不同群体中的分布表现出明显的种族特异性。准确的HLA分型以及可靠的HLA基因频率数据，不仅可广泛用于器官移植和造血干细胞移植中寻找HLA相匹配的供者，而且是研究HLA与疾病相关、亲子鉴定、个体识别以及群体遗传学研究所必需的基本数据。我们报告的这例样本在用美国G&T公司 Lot RF08分型试剂做HLA低分辨率分型时A位点只检出A*24，未检出A*30基因。究其原因可能是该试剂设计的A*30基因的引物位置包含了外显子2的碱基121?126。A*30组基因（A*300101?3016）除了A*3012碱基121?126为CGCGGG以外，其余基因的碱基121?126均为AGTGGA ，这是该组基因的特异性区域。G&T公司 Lot RF08分型试剂A*30引物可检测出A*3001?11，13?15，不包括A*3012，故推测它的引物设计在此位置，其中碱基121?126为AGTGGA。而该新等位基因的3个突变点恰巧在此位置，突变后碱基121?126为CGCGGG，使该基因在此位置失去了特异性（IMGT/HLA release 2.13, April 2006），故只检测出A*24，未检出A*30基因。FLOW?SSO的分型结果也未显出异常格局。由此引发我们的思考。在现今"造血干细胞捐献者资料库"分型资料采用低分辨率入库的状况下，可能会有一些标本由于客观原因而导致漏检，也可能有新等位基因而未被发现。HLA系统中I类分子外显子2、3具有多态性，血清学特异性主要由2、3外显子决定，而外显子4显示进化上的保守性。这3个外显子编码HLA?I类分子重链的3个功能区α1、α2、α3 ［2］。HLA多态性形成的机制多为碱基突变，有一些碱基突变发生在三联密码子的第3位，往往造成同义突变，也就是氨基酸不发生变化；而有一些碱基突变则为有意义突变，会造成氨基酸的改变，从而HLA分子结构和功能也将发生相应的改变。我们此次发现的A*3018与其最相近的HLA? A*300101相比，在exon2有3个碱基不同，碱基121A→C、 123T→C导致密码子17 AGT → CGC, 使第17位氨基酸由丝氨酸变为精氨酸；而碱基126A→G突变发生在三联密码子的第3位，导致密码子18 GGA →GGG，第18位氨基酸仍是甘氨酸，为同义突变。由于实验试剂的限制，我们未能及时确认该等位基因的血清学特异性，这是此次对该基因的研究和报道的不足之处，但这也督促我们对该基因做更深入的研究。待血清学特异性进一步确认后我们会及时公布。近年来针对高变区的测序被广泛应用，新基因频频发现。目前有关HLA新等位基因的发现工作在我国呈现出一种蓄势待发争先恐后的态势。自2002年我们研究室率先在中国大陆发现3个新等位基因［3?5］以后，截止到2006年6月，中国大陆共发现43个有籍可查的HLA新等位基因［6］。2006年9月我们研究室又向WHO申报了2个新等位基因并获命名［7］。A*30在中国南方汉族人群的基因频率为0.0293，北方人群为0.0733，南北方人群有显著差异［8］。而其在韩国人群中的基因频率为0.0537（A*3001为0.0351，A*3004为0.0186）［9］，突尼斯人群为0.1120（A*3001为0.0408，A*3002为0.0566，A*3004为0.0100）［10］，伊朗人群为0.062（A*3001为0.022，A*3002为0.028，A*3004为0.006，A*3009为0.006）［11］，墨西哥人群为0.0583（A*3001为0.0049，A*3002为0.0485，A*3004为0.0049）［12］。由此可以看出A*30在各种族中的分布并不均衡。我们的A*3018等位基因携带者属北方人群，其在我国南北方人群中的分布还有待进一步的研究调查。随着我国骨髓库和脐血库的相继建立与完善，非亲缘供者数量的不断增加以及HLA分型技术的标准化，因此具有中国人群特异性的HLA新等位基因发现的数量必将进一步增加［13］。无限增殖化B淋巴细胞系的建立，可以为基因的克隆、序列分析以及其它研究方法大量保存和繁殖珍贵的生物医学实验材料，尤其对于新基因日后更深入的研究提供了保障。HLA新等位基因的出现增加了HLA系统多态性，对器官移植、法医学鉴定以及人类迁移和人类遗传学研究具有重要意义。
【】
1Robinson J, Malik A, Parham P, et al. IMGT/HLAdatabase— a sequence database for the human major histocompatibility complex. Tissue Antigens, 2000; 55: 280-287
2曹孟德，秦东春，孙含笑. HLA分子生物学与临床应用. 河南： 河南医科大学出版社, 1998： 16-17
3Wu GG, Cheng LH, Zhou D, et al. Identification of a novel allele HLA?B*5610 in a Chinese Potential bone marrow donor. Tissue Antigens, 2003; 61: 256-258
4Wu GG, Cheng LH, Li Z, et al. Identification of a new HLA allele, A*1114, in a Chinese family. Tissue Antigens, 2003; 61：253-255
5Wu GG, Cheng LH, Deng ZH, et al. Cloning and complete sequence of a novel HLA?A null allele, A*0253N, with a termination codon generated by a C to G mutation in exon 2. Tissue Antigens, 2002; 59: 328-330
6孙玉英，奚永志. 我国大陆人群HLA新等位基因发现的现状及应注意的问题. 中华医学杂志, 2006; 86: 2233-2235
7Li Z, Zou HY, Shao CP, et al. Identification of a novel HLA?B*56 allele, B*5618, and an extension of B*2736 by sequence?based typing. Tissue Antigens, 2007; 69:365-366
8吴国光，邓志辉，高素青等. 6965名汉族骨髓供者HLA多态性分析. 中华血液学杂志, 2004; 25: 473-477
9Lee KW, Oh DH, Lee C, et al. Allelic and haplotypic diversity of HLA?A, ?B, ?C, ?DRB1, and ?DQB1 genes in the Korean population. Tissue Antigen, 2005; 65: 437-447
10Ayed K, Ayed?Jendoubi S, Sfar I, et al. HLA Class?Ⅰ and Class?Ⅱ phenotypic, gene and haplotypic frequencies in Tunisians by using molecular typing data. Tissue Antigen, 2004; 64: 520-532
11Farjadian S, Naruse T, Kawata H, et al. Molecular analysis of HLA allele frequencies and haplotypes in Baloch of Iran compared with related population of Pakistan. Tissue Antigen, 2004; 64:581-587
12Leal CA, Mendoza?Carrera F, Rivas F, et al. HLA?A and HLA?B allele frequencies in a Mestizo population from Guadalajara, Mexico, determined by sequence?based typing. Tissue Antigen, 2005; 66: 666-673
13奚永志. 我国骨髓库/脐血库HLA分型应注意的几个问题. 中华医学杂志，2003; 83: 443-445
