同种异基因造血干细胞移植受者血清白介素18水平与急性移植物抗宿主病的关系
【摘要】 本研究探讨同种异基因造血干细胞移植(allo?HSCT)受者血清白介素18(IL?18)与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的关系，查明血清IL?18在aGVHD发病中的作用，为临床早期预测aGVHD提供可靠指标。采用双夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测62例allo?HSCT患者移植前及移植后aGVHD发生前后血清IL?18表达水平。62例患者被分为5组：A组为无aGVHD移植前组（28例），指移植后没有发生aGVHD的患者在移植前收集的标本;B组为有aGVHD移植前组（34例）, 指移植后发生aGVHD的患者在移植前收集的标本;C组为aGVHD症状前组（34例）, 指临床出现I-II级aGVHD症状前3-4天的标本；然后根据I-II级aGVHD患者后，有无进展至III-IV级回顾性地将aGVHD前组患者分为疗效好组（18例）和疗效差组（16例）;D组为I-II级 aGVHD组；E组为III-IV级aGVHD组（16例）。结果表明： 34例患者发生I-II级aGVHD，其中16例aGVHD进展至III-IV级；发生aGVHD患者的血清IL?18表达水平显著高于未发生aGVHD患者, 血清IL?18表达水平上升发生在aGVHD临床症状出现前3天左右；血清IL?18表达水平与aGVHD的严重程度呈正相关,与HLA配型、预处理方案及感染无关；aGVHD早期血清IL?18表达水平与预后相关；血清IL?18高表达者aGVHD容易进展至III?IV级。结论： 血清IL?18 与aGVHD的发病相关联,检测血清IL?18 水平有助于aGVHD早期诊断，血清IL?18表达水平可作为评估aGVHD病情、判断预后的指标。
【关键词】 同种异基因造血干细胞移植 白介素?18 急性移植物抗宿主病 早期预测
Correlation between Serum Levels of IL?18 and Acute Graft Versus Host Disease in Patients after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation
Abstract This study was aimed to investigate the correlation between the serum levels of IL?18 and acute graft versus host disease (aGVHD) in patients received allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo?HSCT)， and to explore the role of serum IL?18 levels in the pathogenesis of aGVHD so as to provide a reliable and early indicator for the diagnosis of aGVHD. 62 patients received allo?HSCT were enrolled in this study. Before and after transplantation, as well as at onset of aGVHD. the serum levels of IL?18 were analyzed by ELISA. 62 patients were divided into 5 groups: group A without aGVHD (28 cases) referred to the patients who had no aGVHD after transplantation and whose specimen were collected before transplantation; group B with aGVHD before transplantation (34 cases) referred to the patients who had aGVHD after transplantation and whose specimen were collected before transplantation; group C before the onset of aGVHD (34 cases) referred to patients with I-II grade a GVHD whose specimen were collected before 3-4 days, and according to whether the I-II grade aGVHD patients developed III-IV grade or not after treatment, these patients were divided into two subgroups retrospectively, one subgroup had good curative effect ( 18 cases) and the other subgroup had not (16 cases); group D with I-II grade aGVHD; group E with III-IV grade aGVHD (16 cases). The results showed that 34 patients developed I-II grade aGVHD, then out of them 16 patients (16/34) developed III-IV grade aGVHD. The serum levels of IL?18 in these patients with aGVHD were higher than that in patients without aGVHD. About 3 days before onset of aGVHD, the serum levels of IL?18 started to increase. The serum levels of IL?18 were correlated with the severity of aGVHD, but no correlation was found with infection, conditioning regimens and disparity of HLA?typing. The serum levels of IL?18 in the early stage of aGVHD were correlated with prognosis. The aGVHD of patients with higher serum levels of IL?18 easy developed to III?IV grade aGVHD. It is concluded that the serum level of IL?18 in the patients received allo?HSCT is related to the occurrence of aGVHD. Detections of serum IL?18 are helpful for the early diagnosis of aGVHD, and the serum levels of IL?18 may be considered as a reliable indicator to evaluate the prognosis and severity of aGVHD.
Key words allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; IL?18; acute graft?versus?host disease; early prediction
J Exp Hematol 2007; 15(3):553-557
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)同种异基因造血干细胞移植受者血清白介素18水平和急性移植物抗宿主病的关系 急性移植物抗宿主病（aGVHD）是同种异基因造血干细胞移植（allo?HSCT）的主要并发症之一。已有的研究表明，aGVHD 发生与细胞因子密切相关［1-4］。目前临床上主要根据皮肤、肝脏、胃肠道受累症状的出现和程度对aGVHD进行诊断和分级，缺乏直接的免疫学证据，因此需要寻找一种能够直观、实时反映aGVHD的免疫学指标。本研究采用双夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测62例allo?HSCT患者(其中HLA配型不合/单倍型相合的34例)移植前及移植后aGVHD发生时血清IL?18表达水平，以探讨血清IL?18在aGVHD发病中的作用，为临床早期诊断aGVHD提供可靠指标。至今为止，有关allo?HSCT后血清IL?18水平报道，均为HLA全相合单纯allo?BMT或allo?PBSCT受者血清IL?18水平检测结果，我们第一次报道HLA配型不合/单倍型相合allo?BMT加allo?PBSCT受者血清IL?18水平与aGVHD的关系。
材料和方法
病例
62例allo?HSCT患者为2004年1月至2004年11月期间北京大学人民血液病研究所骨髓移植病房住院病人, 男43例，女19例，中位年龄30(9-49)岁。62例中诊断为急性淋巴细胞白血病(ALL)13例, 急性髓系白血病(AML)15例, 慢性髓系白血病(CML)27例,骨髓增生异常综合征(MDS)3例,非霍杰金淋巴瘤（NHL）2例，再生障碍性贫血（AA）1例，多发性骨髓瘤（MM）1例。HLA配型全相合28例，HLA配型不合34例，1个位点不合4例,2个位点不合18例,3个位点不合12例。所有患者均签署知情同意书。本研究选择34例I-II级aGVHD患者（HLA配型不合和全相合分别为20和14例），其中16例为I-II级进展至III-IV级aGVHD患者（HLA配型不合和全相合分别9例和7例），同时选择28例无aGVHD患者作为对比（其中HLA配型不合和全相合各14例）。aGVHD的诊断及分级参照［5］。62例患者分为5组： A组为无aGVHD移植前组（28例），指移植后没有发生aGVHD的患者在移植前收集的标本; B组为aGVHD移植前组（34例）, 指移植后发生aGVHD的患者在移植前收集的标本; C组为aGVHD症状前组（34例）, 指临床出现I-II级aGVHD症状前3-4天的标本, 根据I-II级aGVHD患者治疗后，有无进展至III-IV级回顾性将aGVHD前组患者分为疗效好组（18例）和疗效差组（16例）; D组为I-II级 aGVHD组； E组III-IV级aGVHD组（16例）。28例无aGVHD组与34例有aGVHD组中位年龄无显著差异(P>0.05)。另设感染组（24例），是指没有合并aGVHD时单纯感染患者的标本。
血清标本采集
分别于移植预处理前、预处理后输注干细胞前，移植后住院期间每周1、4采集外周静脉血标本5ml，血液标本经离心后取血清于-80度冻存备用。
血清IL?18检测
患者血清IL?18水平采用人IL?18试剂盒（由深圳市炬英生物科技有限公司提供）用ELISA法检测。主要步骤如下：在微孔板留一空白对照孔,其他孔加血清标本或不同浓度标准品100 μl,加入50 μl生物素标记的抗体；室温孵育3小时后洗涤3次，加入100 μl酶结合物；室温孵育30分钟后洗涤3次，加入100 μl底物；室温避光，显色12至15分钟，加100 μl硫酸，终止反应，450 nm处读取OD值。试剂盒的最小检测浓度为45 pg/ml。
HLA配型、预处理方案 、供者造血干细胞动员及采集 、GVHD预防、植活检测
HLA配型 A、B位点检测方法为低分辨方法，DR位点采用高分辨方法。
预处理方案 阿糖胞苷4 g/m2，HLA配型全相合者用1天（移植前10天），HLA配型不合者用2天（移植前10，移植前9天）；Bu(马利兰） 2 mg/(kg·d)×3天； 环磷酰胺1.8 g/(m2·d)×2天；甲基环己亚硝脲（Me?CCNu）250 mg/m2×1天。
供者造血干细胞动员及采集 供者接受rhG?CSF(日本中外制药株式会社产品）5 μg/(kg·d)，连续皮下注射5-6天，第4天采集骨髓有核细胞；第5至6天采集PBSC，总单个有核细胞数（3-4）×108/kg。
GVHD预防 在经典的环孢菌素A加短程甲氨喋呤方案基础上，加用霉酚酸酯，HLA配型不合者加用抗人胸腺细胞球蛋白预防GVHD。
植活检测 造血重建均经性染色体、PCR?STR指纹图或HLA不合位点位点配型中2项以上证实为完全嵌合体。
以上内容详见文献报道［5］。
结 果
造血重建
28例无aGVHD组与34例aGVHD组输注有核细胞数分别为（8.12±3.31）×108/kg、（7.60±3.0）×108/kg，两者无显著差异(P>0.05)。所有患者均获得造血重建，移植后中性粒细胞>0.5×109/L的中位时间在合并aGVHD组为14(10-20)天,而在无aGVHD组为15(11-25)天,两者无显著性差别(P>0.05)。
血清IL?18与aGVHD发病关系
34例合并aGVHD组与28例无aGVHD组之间移植前血清IL?18水平分别为72.01±27.18、68.89±27.95 pg/ml,两组无显著差异(P>0.05)；移植后合并aGVHD患者，发生III-IV级aGVHD组血清IL?18水平高于I -II级GVHD组(P<0.01),而I-II级aGVHD组高于aGVHD症状前组(P<0.01)； aGVHD症状前组血清IL?18水平比较移植前有显著升高(P<0.01)，即在临床出现aGVHD症状前3天血清IL?18水平已经显著上升（附表）。
aGVHD患者血清IL?18表达水平动态变化
18例I-II级aGHVD患者患病时与缓解后血清IL?18水平分别为396.26±56.44和230.72±46.15 pg/ml,前后比较差异显著(P<0.05)。16例aGVHD从I-II级到III-IV级的患者,血清IL?18水平与aGVHD严重程度成正相关,相关系数=0.909, P<0.01。
血清IL?18与aGVHD预后关系
根据有无进展至III-IV级aGVHD,回顾性地将34例aGVHD症状前组患者分为疗效好组（n=18）和疗效差组（n=16），两组血清IL?18值分别为317.88±47.29和499.46±102.18 pg/ml, 疗效差组血清IL?18水平显著高于疗效好组(P<0.01)。
血清IL?18与感染关系
检测了24例患者移植前与感染发生时血清IL?18的水平,分别为69.33±26.57和82.86±31.51 pg/ml,前后比较差异无显著性(P>0.05)。
血清IL?18与预处理方案关系
检测34例单倍型相合患者预处理前与预处理后血清IL?18表达水平，两组分别为67.27±27.72和80.7±29.54 pg/ml，无显著差异(P>0.05)。
血清IL?18与HLA配型关系
HLA配型全合组与不合组患者在移植前、移植后aGVHD时血清IL?18水平比较显示，全相合组与不相合组无显著差异(P>0.05),但无论是HLA配型全相合组与不相合组患者, aGVHD症状前组、I-II级aGVHD组、III-IV级aGVHD组血清IL?18水平，与移植前比较均显著升高(P<0.01)（表2）。
讨 论
aGVHD的发病机制为造血干细胞移植供者的T淋巴细胞被受者组织抗原激活，这些细胞的增殖、活化与多种细胞因子（CK）及表面分化抗原(CD分子)有关。GVHD发病机制研究发现，CD4+细胞中辅助性T淋巴细胞?1(Th1)亚群与GVHD相关，Th1细胞主要分泌IL?2,INF?γ等(I型炎症因子)，IL?2和IFN?γ在aGVHD发病中起关键作用,控制和放大对异体抗原的免疫应答,并刺激单核细胞分泌多种炎性细胞因子,最终导致aGVHD靶组织的损伤,而细胞因子IL?4和IL?10在aGVHD的发病过程中起抑制作用［6,7］。Fas/FasL系统是介导凋亡的主要途径，表达于包括GVHD靶器官在内的多种器官，鼠实验表明，Fas缺陷者移植后GVHD发生及致死率较高，并伴有血清IFN?γ与TNF?a水平升高，提示Fas/FasL也参与了GVHD的发病机制［8］。IL?18是1995年发现的一种细胞因子, 是18.3 kD的蛋白质。IL?18具有如下免疫调节活性： ①促进T细胞增殖,增强Th1单克隆和富集的多克隆T细胞产生Th1类细胞因子，增强Th1细胞毒效应 ,同时可以抑制IL?4和IL?10的产生［9］；②增加NK细胞的细胞毒作用：在体外实验中, IL? 18 可以增强外周血和脾脏天然杀伤细胞的活性,明显增强NK细胞的细胞毒作用,且呈剂量依赖性；③直接增强FasL 介导的Th1 细胞毒效应［10］ 。因此,我们设想IL?18在造血干细胞移植后的aGVHD发病中起着重要的作用。
国内外有关allo?HSCT后血清IL?18水平报道较少，所见的均为HLA全相合单纯allo?BMT或allo?PBSCT受者IL?18水平检测结果,未见HLA配型不相合/单倍相合allo?BMT加allo?PBSCT受者血清IL?18水平报道。 Fujimori 等［1］用ELISA法检测37 例恶性血液病allo?BMT前后血清IL?18 水平，aGVHD病人血清IL?18 的浓度明显增高并且与其严重程度相一致,在aGVHD得到适当的治疗后，血清 IL?18 的水平降至正常，血清IL?18 水平不受移植前化疗方案、移植物或细菌感染的影响，提示IL?18 在aGVHD 的病理过程中可能起重要的作用，血清IL?18 的水平对预测aGVHD是有价值的。Nakamura等［2］检测18例allo?BMT后血清IL?18浓度,国内徐敏等［3］和居小萍等［4］分别检测10例和15例allo?PBSCT后GVHD患者IL?18 水平,结果与上述报道一致。
我们检测并比较28例HLA相合、34例HLA配型不相合/单倍相合HSCT受者血清IL?18 水平，结果发现IL?18 水平与HLA配型无关，无论HLA相合、还是HLA配型不合/单倍型相合造血干细胞移植受者中发生aGVHD患者的IL?18表达水平均显著高于未发生aGVHD患者, IL?18表达水平与aGVHD的严重程度呈正相关, 与报道一致,提示血清IL?18水平 与aGVHD的发病相关联,检测血清IL?18 水平有助于aGVHD早期诊断。本组结果显示，在aGVHD早期时, 疗效差，进展至III?IV级aGVHD组血清IL?18 水平显著高于疗效好组，这提示血清IL?18水平在一定程度上可作为判断aGVHD的预后指标。目前对aGVHD的防治较为困难，常用的药物如环孢菌素等对某些进展或重度aGVHD患者疗效可能不佳，早期诊治可以及时控制aGVHD发展，改善预后。但目前临床上主要根据症状的出现和程度对aGVHD进行诊断，缺乏直接的免疫学证据，早期症状往往不典型，且容易与感染混淆，以至延误治疗。本研究证实，血清IL?18表达水平与感染的发生无关，而发生aGVHD患者的血清IL?18表达水平显著升高，血清IL?18表达水平在aGVHD 临床症状出现前3天左右已经明显上升，提示检测血清IL?18 水平对aGVHD有较高的特异性，有利于早期预测aGVHD。
【文献】
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2Nakamura H, Komatsu K, Ayaki M, et al. Serum levels of soluble IL?2 receptor, IL?12, IL?18, and IFN?gamma in patients with acute graft?versus?host disease after allogeneic bone marrow transplantation. J Allergy Clin Immunol, 2000; 106(pt2):S45-S50
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