一个AB型开米拉家系遗传状态的研究
作者：杨宝成 喻琼 苏宇清 周丹 金士正 李茜 梁延连 邓志辉
【摘要】 为了研究罕见开米拉血型家系的基因遗传状态，对先证者家系部分样本进行ABO基因序列测定，用流式反向序列特异性寡核苷酸探针方法测定HLA?A、B、DRB1基因位点，用PCR?序列特异性引物法测定HLA?A、B、DRB1基因位点，对16个短串联重复片段位点进行荧光标记复合扩增。结果发现： A3B3型家系的2个体中，ABO基因、HLA?B、DRB1基因、多个STR位点出现了2个以上的等位基因。结论： 利用基因分型技术分析开米拉血型能清楚地提示此罕见血型的遗传状态,增进了对此遗传方式的认识。
【关键词】 开米拉血型，ABO， HLA， STR
Abstract In order to study the genetic status of a rare chimeric family, some samples of A3B3 family were identified by sequencing of ABO gene; flow?rSSO and PCR?SSP were used to detect loci of HLA?A,B,DRB1 genes, and multiplex amplifying with fluorescence?dye were performed for 16 short tandem repeat (STR) loci. The results indicated that two individuals from A3B3 family contained more than two alleles at ABO gene, HLA?B,DRB1 and some STR loci. In conclusion, analysis of chimeric blood group by using genotyping techniques clearly demonstrating genetic status of this rare chimeric blood group promotes further elucidation of the existing state of specific genetic status.
Key words Chimeric blood group, ABO, HLA, STR
开米拉的定义是个体细胞来自两个或多个不同的受精卵。人类血型开米拉可能是遗传性的，也可能是在移植、输血过程中通过输注异源的造血细胞而获得的。先天性开米拉发生在两个受精卵或多个受精卵的胎儿发育中。人类开米拉血型是非常罕见的，常在ABO血型鉴定中存在着混合外观的凝集而引起注意［1-3］。我们实验室在1例ABO亚型的研究中发现其家系存在开米拉现象，现报道如下。
材料和方法
对象
先证者是1名23岁的男性无偿捐血者，他的ABO血清学定为A3B3型，采集到先证者及其弟弟的血液不抗凝血样5 ml。由于先证者父亲去世，未采集到其血液标本。对先证者母亲、哥哥、嫂子及孩子共计4人所采集标本由于条件所限，未能抗凝，只作了ABO血清学血型测定，而未能作进一步分析。本家系个体均为无输血史和移植史的健康个体。
血型血清学检测
血型正反定型按《输血技术操作规程》操作进行。其中试剂单克隆抗A、抗B血清（BIOSCOT, Serological Ltd, UK），抗AB血清（Immucor Inc, Norcross, GA30071， USA），抗H植物凝集素（长春博德公司产品），反定型红细胞为本实验室自制。
基因组DNA提取
PUREGENE?快速盐析法抽提先证者与弟弟2个样本的基因组DNA，DNA终浓度调节至100 ng/μl，A260/A280在1.70。
ABO基因第6、第7外显子直接序列检测
参照Olsson设计的2对引物［4］，5'?CGGAATTCA?CTCGCCACTGCCTGGGTCTC?3', 5'?CGGGATC?CATGTGGGTGGCACCCTGCCA?3'，用于扩增ABO基因第6外显子。5'?GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC?3',5'?CGGGATCCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG?3'，用于扩增ABO基因第7外显子，中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2)一个AB型开米拉家系遗传状态的研究引物由上海生物工程所合成。PCR扩增体系包括：每种dNTP 400 μmol/L，Mg2+ 2.5 μmol/L，Taq酶3 U，模板DNA 500 ng，引物每条0.1 μmol/L，终反应体系50 μl，循环参数为： 95℃ 10分钟，94℃ 60秒,63℃ 90秒,72℃ 60秒，10个循环；94℃ 60秒 ,61℃ 90秒,72℃ 60秒，25个循环，72℃ 10分钟。扩增产物经TaKaRa DNA Fragment Purification Kit(大连宝生物公司产品)纯化，使用循环测序试剂盒（Big Dye Terminator Cycle sequencing Kit，美国ABI公司产品）直接测序，测序的引物与本研究扩增ABO基因第6、7外显子的引物序列相同，正、反方向通测，在ABI3100 DNA测序仪上检测、SeqPOP6BDv1软件分析结果。
HLA?A、B、DRB1基因位点的流式磁珠反向序列特异性寡核苷酸探针法（Flow?rSSO）检测
将DNA样本、底物、Taq酶、引物混合并混匀，加入至扩增板中，按试剂盒（Onelambda公司产品）说明书中的扩增条件进行扩增，扩增后的DNA再按操作说明书进行杂交、染色和读板，由Luminex100IS分析软件分析出HLA?A、B、DRB1的结果。
HLA?A、B、DRB1基因位点的聚合酶链反应?序列特异性引物（PCR?SSP）分型法检测
试剂由美国G&T公司提供。每一标本反应体系为9 μl，内对照为扩增人类生长激素（HGH）基因，目的扩增产物为796 bp或429 bp，扩增采用热启动技术，即95℃预温5分钟，然后95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 90秒，30个循环，72℃延伸5分钟。PCR产物检测经2%琼脂糖凝胶电泳20-25分钟，紫外灯下拍照、打印照片、记录结果。
16个短串联重复片段（short tandem repeat, STR）位点荧光标记复合扩增
采用10 μl扩增体系，内含PCR 反应混合物4.25 μl，荧光标记引物2.5 μl，金牌Taq酶（5 U/μl）0.25 μl，模板DNA 3 μl（约3 ng）。热循环参数： 95℃预变性11分钟；94℃ 1分钟，59℃ 1分钟，70℃ 1分钟，共28个循环，60℃ 延伸45分钟，最后25℃下恒温保存。检测的16个STR位点包括：D5S818, D13S317, D7S820, D8S1179, D21S11, D18S51, D3S1358, vWA, FGA, TH01, D16S539, D2S1338, D19S433, TPOX, CSF1PO和性染色体上Amelogenin位点。荧光标记引物（Identifiler试剂盒）由美国PE公司提供。PCR产物采用ABI3100测序仪进行电泳和检测、GeneScan3.1和GeneTyper3.7软件分析STR基因型。
结 果
血清学结果
先证者与单克隆抗A、抗B血清在显微镜下呈混合外观，与抗H反应呈强阳性，血清与标准A细胞、B细胞无反应。其余个体均为正常ABO血型家系，家系成员的ABO血型见图1。
Figure 1. Schematic diagram of the inheritance of A3B3 in a family. The phenotype determined are indicated by capital letter. Arrow head indicates propositus. Sample shown in dashed square was not studied.
ABO血型基因序列测定结果
与A101等位基因序列（GenBank注册号：AF134412）相比较，先证者为核苷酸位（nt）297A/G、646A/T，681A/G、771C/T、829A/G位有杂合，具有B基因特点的nt297A>G，O02基因特点的nt646T>A，681G>A、771C>T、829G>A，其余位点为A101等位基因的特点；弟弟为nt297A/G、261G有1链缺失、646A/T，681A/G、771C/T、829A/G位有杂合，具有B基因特点的nt297A>G，具有O01基因特点的nt261位有一链缺失G，O02基因特点的646T>A，681G>A、771C>T、829G>A,其余位点为A101等位基因的特点。
HLA基因位点结果
Flow?rSSO法检测结果显示，先证者为A2，?；B39(05)，51；DRB1*8，16；其弟弟为A2，?；B51，52；DRB1*15，16。PCR?SSP检测结果表明，先证者为A2，?，B39，51,58；DRB1*8，13，16；其弟弟为A2，?；B51，52；DRB1*13，15，16。PCR?SSP检测发现这两个体HLA?DRB1基因均出现了3个位点，一个个体HLA?B基因出现了3个位点，B58的电泳条带不是太清晰。结合PCR?SSP与Flow?rSSO检测结果分析，可以得出HLA?B58与HLA?DR1*13等位基因在体内少量存在。先证者弟弟的HLA?DRB1 SSP检测结果见图2。
Figure 2. Electrophoresis result of PCR?SSP for a propositus brother.
Figure 3. Peak value of a short tandom repeat locus (D3S1358)
16个STR位点结果
先证者与其弟弟的16个STR位点结果列于表1，其中D3S1358位点电泳图见图3。16个短串联重复序列位点包括了15个常染色体上的位点，1个XY染色体上的位点。
在先证者中有5个STR位点出现了3个或4个位点，其中括号里的STR特异性与前面位点特异性相比较峰值较低，在体内少量存在；在先证者弟弟中有2个STR位点出现了3个或4个位点，其中括号里的STR特异性与前面位点特异性相比较，在体内少量存在。
讨 论
ABO血型系统是输血医学中最具有临床意义的重要血型系统。ABO亚型基因的编码序列主要位于基因的第6、7外显子上，常见ABO基因中有2个A等位基因，1个B等位基因、2个O等位基因。在O01和O02等位基因之间至少有9个不同的核苷酸，后5个处于第6与第7外显子。到现在为止，在ABO基因编码区已有135个ABO等位基因被报道。绝大多数的A和B亚型基因与普通等位基因相比只有少量的变化，研究表明几种遗传模式（插入、缺失、替代和交叉接合后突变、杂交）影响了A和B糖基转移移酶活性和ABO表型的转化。ABO等位基因中单个突变是非常普遍的，基因重组和转换模式能够引起一系列ABO多态性［5,6］。人群的ABO血型基因具有鲜明的特征［7,8］。
人类白细胞抗原（HLA）是人类至今所知最复杂的免疫遗传多态性系统，它的频率及连锁不平衡类型在不同人种、民族、地域存在明显差异［9］，HLA中A、B、DRB1的基因位点具有着紧密连锁特征，HLA系统在人类遗传学上形成了极好的群体标志。
STR是存在于人类基因组DNA中的一类具有长度多态性的DNA序列，不同数目的核心序列呈串联重复排列，一般为2-6个碱基［10］。核心序列拷贝数目的变化产生长度多态性，通常多态性片段长度100-300 bp。一般认为，人类基因组DNA中平均每6-10 kb就有1个STR位点。不同人体基因组卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一，应用STR基因分型技术就可将不同个体进行区别，并可进行个体间的遗传学分析。该方法简便、快速、准确度高，已为目前最主要的法医学亲子鉴定和个体识别检测标记。
综上述原因，我们对此例ABO血型鉴定中出现了混合外观的标本，选择了HLA?A、B、DRB1基因、15个常染色体的STR位点，1个性染色体的STR位点进行深入分析。
ABO的基因序列测定结果中，发现与序列相比，不能够只定为目前已被报道的常见的2条单倍型，这有两种可能性：一是先证者及弟弟具有3条单倍体，其中1条的数量很少，有些位点不能准确检测出；二是先证者与弟弟含有1个Ax02等位基因，这种Ax等位基因是染色体上DNA重组后形成了1个杂合的基因［11］，即Ax02等位基因也就是个含297A>G这个典型的B等位基因突变特点的B与O02两个等位基因的杂合基因。
我们可以看到2个样本的HLA?B，DRB1基因使用特异性序列引物法扩增出了少量的另类单倍体。此种方法，在最近国外中也见有报道［12］。
在个体的短串联重复片段的检测中，结果清楚表明了在一些位点中出现了3个或4个异常特异性位点，这再次有力说明这2个个体存在着基因嵌合现象。这种遗传状态的存在是因为母体在减数分裂过程中，在子代体内出现了异常组合。STR位点中有些位点没有出现异常，这可能是在父源、母源中可能含有相同的重复数目而被遮盖。
由于此2个体均无输血史、任何移植史，可以排除人工开米拉的可能。
人类血型开米拉是较为罕见的，我们这例标本就是因为在常规ABO血型鉴定中呈现混合外观，而进一步选择了ABO基因、HLA多态性基因、STR位点，对开米拉血型的遗传背景作了深入研究，结果表明了此罕见血型的遗传状态,加深了我们对此类罕见的遗传模式认识，而且提示我们应将进一步探讨这个家系血型异常表达的遗传与调控机制。
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