off调控bcr/abl基因表达的细胞系 293pT2?P210的建立

作者：黄文荣 鲁茁壮 王立生 王华　段海峰 李庆芳 高春记 达万明

【摘要】  　　 慢性髓系白血病（CML）是一种以髓系细胞受累为主的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为：位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因，并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl融合蛋白，该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。本研究为构建能由Tet?off诱导表达系统调控bcr/abl融合基因表达的细胞系，为深入研究bcr/abl融合基因功能及其调控机制提供一种有价值的细胞模型。将bcr/abl融合基因亚克隆到pTRE2hyg载体构建重组质粒pT2?P210，同时将Tet?off质粒转染293细胞并筛选出单克隆，然后进一步转染pTRE2hyg?LUC质粒，通过荧光素酶活性检测选出能有效诱导目的基因表达的293Tet?off细胞，然后将重组质粒pT2?P210转染到293Tet?off细胞中。结果表明：筛选出了bcr/abl融合基因能被强力霉素有效调控的293 pT2?P210单克隆细胞。结论：本研究筛选的293pT2?P210细胞为bcr/abl基因表达能被Tet?off诱导表达系统调控的细胞系，它们适用于bcr/abl融合基因功能及其信号调控机制的深入研究。

【关键词】  bcr/abl融合基因；Tet?off诱导表达系统；293pT2?P210细胞系；293细胞

　　 Construction of 293pT2?P210 Cell Line Enables Expression of bcr/abl to be Regulated by Tet?off Inducing?Expression?Syste

    Abstract    Chronic myelogenous leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease of transformed hematopoietic progenitor cells. It is now clear that the chimeric bcr/abl P210bcr/abl fusion protein, which is generated by the reciprocal translocation t(9;22), inhibits apoptosis and increase proliferation. P210bcr/abl plays a central role in the pathophysiology of CML. The purpose of this study was to construct a cell line model that bcr/abl expression can be regulated by Tet?off inducing?expression?system. The full?length b3a2 bcr/abl cDNA was subcloned into the pTRE2hyg expression vector to construct the pT2?P210 plasmid. 293 cells were firstly transfected with Tet?off plasmid and  the clone that the Tet?off system can work effectively after transfected with pTRE2hyg?LUC was selected by luciferase activity assay. The pT2?P210 plasmid was then transfected into the selected clone and cells were then selected for hygromycin B and G418 resistance. The results showed that individual subclones expressing bcr/abl after withdrawing doxycycline  were 293pT2?P210 cell line. In conclusion, selected 293pT2?P210 cells are cells that  bcr/abl expression can be regulated by Tet?off inducing?expression?system. They are suitable thoroughly   to study  the function of bcr/abl fusion gene and its signal regulation mechanisin.

    Key words    bcr/abl fusion gene; Tet?off inducing?express?system; 293pT2?P210 cell line; 293 cell

        慢性髓系白血病（chronic myelogenous leuke? mia,CML）是一种髓系克隆性疾病。CML全球年发病率约1/10万人口，占全部白血病的20%左右，中位生存期为3-4年。CML是目前致病分子信号基础研究最为清楚的肿瘤之一，1960年Nowell和Hungerford在CML患者的白血病细胞中发现Ph染色体［1］，1973年Rowley等［2］进一步应用染色体分带技术证明，Ph染色体是由9q34的abl基因和22q11 的 bcr 基因相互易位形成的 bcr/abl 融合基 因。近95%的CML患者存在Ph染色体，在CML中约 98% bcr/abl 融合基因编码的融合蛋白为P210bcr/abl，该蛋白具有很强的蛋白酪氨酸激酶活性［3］。P210bcr/abl被认为是CML的分子发病基础，它导致下游一系列信号持续磷酸化而使异常造血干细胞克隆出现抗凋亡、增殖失控和粘附功能缺陷等病理生理变化。在本研究中我们构建了能由Tet?off诱导表达系统调控bcr/abl融合基因表达的细胞系，为深入研究bcr/abl融合基因功能及其调控机制提供了一种有价值的细胞模型。

    材料和方法

    细胞、质粒、菌种与试剂

    293细胞株（军事医学院放射医学研究所3室保存）。pTRE2hyg、Tet?off和pTRE?LUC质粒（军事医学科学院贺福初院士赠送）。bcr/abl基因片段（医学科学院血液学研究所赵春华教授赠送）。DH-5α大肠杆菌感受态细胞、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶PvuⅡ,HpaⅠ,SpeⅠ,XbaⅠ,EcoRⅠ,BamHⅠ,HincⅡ、引物合成及DNA测序（TaKaRa公司产品）。质粒小量制备试剂盒（Gibco公司产品）。Lipofectamine、DNA片段回收试剂盒、Marker λHindⅢ、DL2000（北京天为时代公司产品）。多西环素、Bright Luciferase Assay Kit（Promega公司产品），潮霉素（Boehringer Mannhein公司产品）。荧光检测仪（中国科学院生物物理研究所， Z2000型）。

    重组质粒的构建

    使用PvuⅡ酶切pTRE2hyg载体2-3小时之后进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，应用DNA回收试剂盒从凝胶中回收、纯化DNA。然后对回收的线性化pTRE2hyg载体进行5′ 端去磷酸化处理，重新回收去磷酸化的线性化载体pTRE2hyg。同时应用T4 DNA聚合酶对bcr/abl基因进行平端化处理，将补平的bcr/abl基因片段与去除5′ ?P的线形化载体在T4 DNA 连接酶的作用下16℃保温连接16-20小时后取5 μl进行转化反应。

    转化反应

    DH?5α大肠杆菌感受态细胞作为转化反应细胞，按试剂盒操作说明进行，转化后12-16 小时在琼脂平板上挑取单个细菌菌落于5-7 ml  LB/Amp培养基培养8-10 小时，然后进行质粒DNA的提取。

    质粒DNA的提取

    大肠杆菌质粒DNA的提取按试剂盒说明进行。对提取的质粒DNA取样进行酶切鉴定，对酶切鉴定正确的克隆进一步取样进行测序分析。将bcr/abl基因与pTRE2hyg载体正确连接的重组质粒称为pT2?P210质粒。

    Tet?off质粒转染293细胞

    根据Tet?off系统说明书，按Lipofectamine试剂的操作要求在6孔培养板中将Tet?off质粒转染到293细胞， 8小时后将转染后的细胞按1∶15传代，并用终浓度为1 000 ng/ml的G418筛选293细胞；待细胞有克隆形成时，显微镜下使用无菌钢圈罩住单个克隆并用胰酶消化下克隆后进行单克隆的培养，所获得的克隆为293Tet?off细胞。

    能有效诱导目的基因表达293Tet?off细胞的筛选

    按Lipofectamine试剂的操作要求在96孔培养板将含荧光素酶的pTRE2hyg?LUC质粒转染前面所挑选的不同克隆来源293Tet?off细胞，每个克隆接种4个孔，将脂质体?DNA复合液加入到96孔板中时，每个克隆中2孔加入多西环素2 μg/ml，另外2孔不加多西环素。培养48小时后将细胞按荧光素酶活性检测试剂盒要求操作测定各孔荧光强度，选出不加多西环素与加多西环素孔荧光强度的强度相差20倍以上的克隆作为能有效诱导目的基因表达的293Tet?off细胞。

    293Tet?off细胞的pT2?P210重组质粒转染

    按Lipofectamine试剂的操作要求在6孔培养板中将构建的pT2?P210质粒转染到所筛选293Tet?off细胞，将脂质体?DNA复合液加入到6孔板中同时加入多西环素2 μg/ml，48小时后将细胞按1∶15传代，并用终浓度为200 ng/ml的潮霉素筛选感染有PT2?P210基因的293Tet?off细胞；待细胞有克隆形成时，无菌钢圈罩住单个克隆并用胰酶消化下克隆后进行单克隆的扩大培养，成功转染pT2?P210的293Tet?off细胞命名为293pT2?P210细胞。

    293pT2?P210单克隆细胞bcr/abl基因表达的RT?PCR检测

    撤除多西环素48小时后，取1×106细胞，应用TRIzoL (Invitrogen公司产品)一步法提取细胞总RNA，并逆转录合成cDNA第一链后行PCR扩增bcr/abl片段，内参照为β?actin。bcr/abl的上游引物，5′CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG 3′，下游引物5′ CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA3′，扩增产物165 bp。β?actin上游引物，5′GGGACCTGA CTAACTACCTC 3′，下游引物，5′CAGTGATCTCCT TCTGCATC 3′，扩增产物396 bp。PCR反应条件：96℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环后72℃延伸10分钟，取产物10 μl在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

    结    果

    pT2?P210重组质粒的酶切位点分析

    将bcr/abl融合基因全长编码序列以平端连接方式连接入pTRE2hyg多克隆位点，并根据pTRE2hyg与Bcr/Abl正向连接产物的全长序列进行限制性内切酶分析。BamHI酶切pT2?P210重组质粒产生大小为1 268 bp，1 566 bp和8 801 bp的3个片段；XhoI酶切pT2?P210重组质粒产生大小为612 bp，1 419 bp和9 605 bp的3个片段。

    酶切鉴定

    pTRE2hyg与bcr/abl连接产物转化大肠杆菌后共长出8个克隆，挑取全部克隆进行培养扩增提取质粒，根据质粒电泳图选出分子量大小基本正确的克隆4，进一步应用限制性内切酶BamHI、XhoI对该克隆质粒进行酶切鉴定，酶切结果见图1，酶切片段大小与预先的pTRE2hyg+Bcr/Abl 正向连接产物限制性内切酶分析结果吻合，酶切鉴定初步提示该克隆为pTRE2hyg与bcr/abl正向重组质粒pT2?P210，于是进一步对质粒DNA序列测定进行分析。

   测序鉴定

    根据bcr/abl融合基因b3a2融合方式的全长编码序列在CDS两端设计引物，对前述挑选克隆的质粒DNA进行测序，并将测序结果及BLAST同源性比对结果如下：

    质粒DNA的bcr端测序结果:

    该克隆质粒DNA的测序结果被证实为pTRE2hyg与bcr/abl正向重组质粒，即所需的pT2?P210重组质粒，该质粒包含了bcr/abl融合基因的全长CDS，可使用该重组质粒进行转基因实验以研究bcr/abl基因及其编码的P210bcr/abl蛋白功能。

    转pTRE2hyg?LUC质粒的293Tet?off细胞荧光素酶活性检测

    Tet?off转染293细胞共筛选出9个293Tet?off单克隆细胞，如图2所示，第1号至第9号克隆在无多西环素时的荧光素酶活性分别为多西环素存在时的22、19.8、13.2、14.2、1.6、1.3、11.9、2.7和12.7倍，第1号克隆的荧光素酶活性在多西环素存在时被抑制最为显著。按照Tet?off诱导表达系统说明书应选出不加多西环素比加多西环素时荧光强度高20倍以上的克隆作为能有效诱导目的基因表达的细胞克隆，故选用第1号克隆进行目的基因pT2?P210的转染。

    Figure 2. Luciferase activity of different clones.

    293?P210细胞的bcr/abl基因表达检测

    pT2?P210质粒转染所筛选293Tet?off细胞后潮霉素筛选到6个单克隆，胰酶消化下克隆后进行单克隆的扩大培养，并在撤除多西环素后取样细胞,应用TRIzoL一步法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA第一链后行PCR扩增bcr/abl片段，可见6个单克隆均在撤除多西环素后能有效诱导目的基因bcr/abl基因表达（图3），提示这6个克隆均为成功转染了pT2?P210质粒的293pT2?P210细胞。

　　讨    论

    Tet?off诱导表达系统是20世纪90年代以来Bujard等人创建的一种利用原核调控元件在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系［4］。该体系由大肠杆菌Tn10转座子中四环素阻遏操纵子的两个部件［四环素阻遏蛋白（tetracycline repressor protein, TetR）和四环素操纵子序列（tetracycline operator,TetO）］与四环素（tetracycline，Tc）及其衍生物多西环素（doxycycline，Dox）组成。在Tet?off系统中，TetR与单纯疱疹病毒的VP16转录活化域组成融合蛋白，即四环素控制的反式活化因子（tetracycline?controlled transactivator, tTA），该因子通过7个拷贝的TetO和部分CMV启动子组成的四环素反应元件(tetracycline response element, TRE)共同控制下游基因的表达：当Tc或Dox存在时，tTA与Tc或Dox结合，导致tTA与TRE的结合能力下降，从而关闭下游基因；当Tc或Dox不存在时，tTA与TRE结合，启动下游基因的转录［4-6］。

    我们在将bcr/abl融合基因连接到含四环素反应元件序列的pTRE2hyg载体构建pT2?P210重组质粒的同时，将Tet?off质粒转染到293细胞构建293Tet?off细胞，并使用含荧光素酶的pTRE2hyg?LUC质粒转染不同克隆来源的293Tet?off细胞挑选出能通过四环素控制的反式活化因子有效诱导目的基因表达的293Tet?off单克隆细胞。然后进一步将所构建的pT2?P210重组质粒转染到选出的293Tet?off单克隆细胞，按pTRE2hyg载体上的选择标记使用潮酶素选择转染pT2?P210质粒的293Tet?off单克隆细胞。根据多西环素撤除后Tet?off诱导表达系统能够诱导目的基因表达，筛选出bcr/abl融合基因能在多西环素撤除后有效表达的单克隆细胞为293pT2?P210细胞系。该293pT2?P210细胞系能被Tet?off诱导表达系统有效调控bcr/abl融合基因的表达，是一种理想的细胞模型，可以较为方便地用于研究P210bcr/abl融合蛋白功能及其下游信号通路的调控机理。

【】
  1 Nowell PC, Hungerford DA. Chromosome studies on normal and leukemic human leukocytes. J Natl Cancer Inst, 1960; 25:85-109

2Rowley JD. Letter. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluore? scence and Giemsa staining. Nature, 1973; 243(5405):290-293

3McWhirter JR, Wang JY. Activation of tyrosinase kinase and microfilament?binding functions of c?abl by bcr sequences in bcr/abl fusion proteins. Mol Cell Biol, 1991; 11: 1553-1565

4Gossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline?responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89: 5547-5551

5Freundlieb S, Schirra?Muller C, Bujard H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med, 1999; 1:4-12

6Gossen M, Freundlieb S, Bender G, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science, 1995; 268(5218):1766-1769