大鼠失血性休克继发凝血活化的实验治疗

           作者：王晓蓉　潘景业　朱椰凡　陈洁　王明山　 王卫　全世超　 唐敏

【摘要】  　　为了探讨不同复苏液对失血性休克大鼠凝血功能的影响和可能机制，将50只SD大鼠随机分为5组：对照组、假手术组、休克组、复苏1组（输林格液）和复苏2组（输林格液+万汶液），每组10只大鼠。建立失血性休克大鼠模型后，复苏组在失血性休克1小时后给予不同复苏液（林格液、6%中分子羟乙基淀粉130/0.4即万汶液），复苏2小时后采血，检测血浆组织型纤溶酶原激活剂（t?PA）、组织型纤溶酶原激活剂抑制物?1（PAI?1）、组织因子(TF)的变化。研究结果表明：与对照组、假手术组比较，休克组和复苏1组的t?PA、t?PA/PAI?1、TF水平均明显升高(P<0.01)；复苏1组t?PA、t?PA/PAI?1水平明显高于休克组（P<0.01）；而复苏2组t?PA、t?PA/PAI?1、TF均明显低于休克组和复苏1组（P<0.01）。结论：大鼠失血性休克可使纤溶功能亢进，血小板和凝血系统被活化；采用万汶液加林格液复苏在调节凝血功能方面优于单用林格液。

【关键词】  失血性休克； 凝血因子； 输液； 万汶液；林格液

　　Experimental Therapeutic Study for Activated Coagulation by Hemorrhagic Shock in Rats

    Abstract    The study was aimed to investigate the changes of blood coagulation factors during hemorrhagic shock in rats and the effects of various of resuscitation fluids on   expression of blood coagulation factors in rats with hemorrhagic shock and to clarify its possible mechanism.  50 SD rats were randomly  divided into 5 groups: control, sham operation, shock, resuscitation 1 (infusion with Ringer's lactate) and resuscitation 2  (infusion with 6% VOLUVEN ),   10 rats per group.  The rats in resuscitation 1 and resuscitation 2  groups were subjected to hemorrhagic shock，   after  hemorrhage shock for    1 hour   resuscitation was performed with Ringer's lactate and 6% VOLUVEN. After resuscitation   for 2 hours the  changes of t?PA， PAI?1， TF were measured. At the same time，  the  rats in shock and the sham operation groups were bloodleted out so as to test. The results showed that the levels of  plasma t?PA， t?PA/PAI， TF in the shock and resuscitation 1  groups were significantly higher than that  in control and sham operation groups  (P<0.01). The levels of plasma t?PA，  t?PA/PAI in resuscitation 1  group were higher than that in shock group (P<0.01),   the levels of plasma t?PA， t?PA/PAI and TF in the resuscitation 2 group  were significantly lower  than that in shock and resuscitation 1 groups (P<0.01). It is concluded that hemorrhagic shock may trigger the coagulation cascade reaction, results in hyperfunctioning of fiberinolysis and activation of platelets and coagulation system, and so the coagulation factor is  greatly consumed. Unbalance of coagulation system plays an important role in the progress of shock. Efficacy of resuscitation with 6% VOLUVEN plus Ringer's lactate may be  better than Ringer's lactate alone in regulating blood coagulation after hemorrhagic shock in rats.

    Key words    hemorrhagic shock; blood coagulation factor; transfusion therapy; 6% VOLUVEN; Ringer's lactate

    J Exp Hematol 2007; 15(2):396-398

    休克的发生机制未彻底阐明，其病理生过程非常复杂。现在对休克与弥散性血管内凝血（DIC）的关系研究得比较明确，在休克发展到晚期均有可能发生DIC［1］。休克一旦并发了DIC，病情将恶化，微循环和各器官功能将受到严重影响，给治疗造成极大的困难。

    创伤后因失血或血浆渗出所致的循环血量减 少，在临床处理上通常给予输液复苏。此治疗措施可获得一定疗效，但关于液体复苏目前尚存在一些争议［2，3］。有研究者认为创伤失血后，输液复苏过程本质上是一种缺血再灌注的损伤过程。缺血再灌注损伤时，首先受损的是血管内皮细胞，血管内皮细胞受损使血管内皮下组分暴露、血小板激活和凝血因子及组织因子的释放，从而使血液凝固性增高。本研究探讨大鼠失血性休克后采用林格液和6%万汶液复苏时血浆组织型纤溶酶原激活剂（t?PA）、组织型纤溶酶原激活剂抑制物?1（PAI?1）、组织因子(TF)的变化，以阐明失血性休克早期凝血启动机制，为在休克早期保护机体功能、提高休克后存活率提供理论指导。

     实验动物与分组

    选用温州医学院动物中心提供的健康、成年SD大鼠，体重250-300 g，雌雄不限。50只大鼠随机分为对照组、假手术组、休克3小时组（休克组）、复苏1组（输注林格液组）和复苏2组（输注林格液加万汶液组)，每组10只动物。实验前禁食过夜，但自由饮水。

    失血性休克模型的建立

    大鼠用20%(4 mg/kg)乌拉坦腹腔注射麻醉后分离左侧颈总动脉和右侧颈外静脉。用22-18G动脉穿刺针行动脉插管，整个管道系统预充0.9%生理盐水液。经三通及压力传感器与多功能监护仪相连。在右侧颈外静脉穿刺、插管，后者用于输液兼抽血、留取标本。对照组：先将鼠尾泡于45℃-50℃热水中，揩干后自尾尖向尾根剪5-10 mm取血，再自尾根向尾尖按摩，血自尾尖流出；每次取血时间点同创伤组及休克组。假手术组：仅行颈动静脉插管，未予以放血观察3小时后，取血标本；其余3组均按Lamson法快速放血使平均动脉压(MAP)降至40 mmHg，记为休克开始。方法同张艳杰等［4］失血性休克模型制作。休克组：不给予任何处理，每半个小时记录血压变化，3小时后取血标本。复苏1组：休克稳定1小时后通过回输失血量3倍的乳酸林格氏液，复苏2小时后取血标本。复苏2组：休克稳定1小时后回输1倍失血量的6%羟乙基淀粉（万汶液）液+2倍失血量的乳酸林格氏液，复苏2小时后取血标本。每组到预定的时间采集静脉血1.8   ml，加入含有0.2 ml(109 mmol/L)枸橼酸钠的抗凝塑料试管中，颠倒混匀后4028×g离心10分钟，分离血浆，立刻置于-40℃冰箱保存待检。

    观察指标与检测方法

    在所有实验大鼠中观察MAP的变化。血浆t?PA、PAI?1及TF含量采用双抗体夹心ABC?ELISA法检测，并t?PA/ PAI?1比值。以上试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司，各项目严格按照说明书操作，在变色龙自动酶标仪（西班牙DIAGNOSTIC GRIFOLS公司）上比色测定。

    统计学方法

    数据以均值±标准差（±SD）表示，采用SPSS  11.0统计软件包处理，多组间相同指标的比较采用单因素方差分析，如差异有统计学意义则进一步行组内两两间比较，方差齐同者采用Student Newman?Keuls检验，方差不齐同者采用Tamhane检验。

    结    果

    各组的t?PA、tPA/PAI?1和TF含量的变化见附表，由表可知，休克组和复苏1组的t?PA、t?PA/PAI?1、TF含量均明显高于对照组、假手术组(P<0.01)；复苏1组的t?PA、t?PA/PAI?1明显高于休克组（P<0.01）；而复苏2组t?PA、t?PA/PAI?1、TF水平均明显低于休克组和复苏1组（P<0.01）。

    讨    论

    在引起DIC的众多病理因素中,休克是一个常见的因素。研究表明,休克导致DIC的机制可能与下列因素有关： ①失血性休克过程中,缺血、缺氧及氧自由基的释放导致血管内皮细胞损伤。血管内皮细胞对于调节凝血、抗凝、纤溶平衡具有重要作用。生理情况下,血管内皮细胞分泌血栓调节素等抗栓物质,防止血栓形成。病理状态时,血管内皮细胞分泌组织因子、纤溶酶原抑制剂等促栓物质,发挥止血作用。当血管内皮细胞损伤持续存在,抗栓因子过度释放时,即出现凝血、抗凝、纤溶失衡。②创伤时组织因子释放入血,直接启动凝血途径。③细胞因子的大量释放,激活凝血途径。正常情况下,机体凝血、抗凝血处于动态平衡。但各种病理过程可打乱该平衡,引起凝血系统的激活。如果触发因素持续存在,凝血因子被大量消耗,将导致凝血系统的崩溃,最终出现失代偿性DIC［5］。代偿性DIC时,常规凝血检测指标可在正常范围内。但敏感性、特异性较高的分子标记物在凝血紊乱早期即可发生改变。与国外报道相符,本研究发现休克大鼠组织型纤溶酶原激活剂（t?PA）、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI?1)等分子标记物在休克早期就发生了变化,在林格液、万汶液的干预下,又各自发生了特点不同的改变。血浆t?PA是由血管内皮细胞和组织细胞合成,主要在肝脏清除,其抑制剂PAI也主要由内皮细胞和血小板产生。机体纤溶功能的强弱主要取决于内皮细胞分泌t?PA/PAI?1的相对比例［6］。如果纤溶系统未充分激活,纤维蛋白将沉积在微循环，形成微血栓,导致多脏器功能衰竭。反之,纤溶系统过分激活将引起出血。当血管内皮细胞受损伤时,t－PA由内皮细胞释放入血,使纤溶酶原转变成纤溶酶,激活纤溶系统。为维持纤溶平衡,PAI大量释放,导致血浆PAI水平升高。

    本研究结果显示：大鼠失血性休克3小时时t?PA含量和t?PA/PAI?1比值明显高于假手术组，表明此时机体纤溶功能处于亢进状态，血小板和凝血系统被活化。本实验采用林格液复苏2小时时，t?PA含量和t?PA/ PAI?1的比值反而高于休克组，万汶液+林格液复苏2小时时，上述指标均明显下降。万汶液是新一代羟乙基淀粉的等张氯化钠溶液，其平均相对分子质量为130 000，取代级为0.4，取代方式约为9/1，分布容积为5.9 L，血浆半衰期1.4小时。上述特点使其更容易从肾脏排泄，从而在血浆和组织内蓄积明显降低，患者不良反应少，过敏反应低，有利于调节机体的凝血功能［7,8］。大鼠失血性休克后输液复苏，存在着缺血再灌注损伤过程。补充林格液时，虽对血管内皮细胞能起到一定的保护作用，但血管内皮细胞同时也受到损伤，如同实验结果所示，t?PA释放增加、t?PA/PAI?1比值升高等，而使用万汶液+林格液复苏时，t?PA、TF水平均明显下降。故失血性休克后采用万汶液+林格液复苏在调节凝血功能方面优于单用林格液。另外，休克3小时时林格液复苏组TF量明显升高。输注万汶液+林格液复苏时TF水平明显下降。TF存在于血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞及各种组织上，在血栓性疾病、弥散性血管内凝血、恶性肿瘤时均可见表达增高并释放至血浆，启动凝血途径［9］。这提示万汶液对凝血具有保护作用。

    综上所述，大鼠失血性休克可导致机体凝血功能一系列的变化；休克早期给予新一代容量复苏剂－万汶液对凝血和纤溶功能起到一定的调控作用，对内皮细胞可能具有直接和特殊的药物效应。

【】
  1梅冰，康舟，霍正禄. 创伤性休克后血浆黏附分子的变化及不同复苏液的影响. 中华实验外科杂志，2004； 21：1544-1546

2陈晓雄，叶恭永，帅学军等. 重症胸部创伤合并创伤失血性休克限制性液体复苏的疗效评价. 急救医学，2004； 24：178-180

3罗正曜. 休克学. 天津：天津技术出版社. 2001: 143-144，754

4张艳杰，潘景业，王明山. 失血性休克大鼠凝血因子的变化研究. 中国实验血液学杂志，2005；13：110-113

5Mammen EF. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin Lab Sci, 2000；13：239-245

6徐斐，王明山，王红等. 肝硬化患者纤维蛋白溶解功能的变化及其意义. 肝脏杂志，2004；9：275-276

7Fries D, Innerhofer P, Klingler A, et al. The effect of the combined administration of colloids and lactated Ringer's solution on the coagulation system: an in vitro study using thrombelastograph coagulation analysis. Anesth Analg, 2002； 94:1280-1287

8Langeron O, Doelberg M, Ang ET, et al. Voluven, a lower substituted novel hydroxyethyl starch (HES 130/0.4), causes fewer effects on coagulation in major orthopedic surgery than HES 200/0.5. Anesth Analg, 2001； 92:855-862

9Nakamura Y, Nakamura K, fukushima?Kusano K, et al. Tissue factor expression in atrial endothelia associated with nonvalvular atrial fibrillation: possible involvement in intracardiac thrombogensis. Thromb Res, 2003; 111:137-141