拮抗TGF?β1可抑制胚胎干细胞来源BL?CFC的产生和分化

                  作者：要晖宇 刘兵 王晓燕 毛宁

【摘要】  　　胚胎干细胞来源的BL?CFC体外可分化产生造血和内皮细胞。为了研究TGF?β1对BL?CFC产生和分化的调控作用，在拟胚体培养阶段施加TGF?β1和TGF?β1中和抗体，观察不同阶段TGF?β1对BL?CFC的数目及其定向内皮和造血细胞分化能力的影响。结果表明：在拟胚体培养阶段拮抗TGF?β1的作用可显著降低BL?CFC的数量(P<0.01)；与之吻合的，中和TGF?β1后拟胚体中Flk?1+细胞比例降低。此外，在拟胚体培养阶段加入TGF?β1可显著增强BL?CFC的造血和内皮细胞分化能力，而中和TGF?β1后分化能力降低。结论： TGF?β1对BL?CFC的产生和分化发挥正向调节作用。

【关键词】  TGF?β1；BL?CFC；胚胎干细胞

　　 Reduction of Blast?Colony Forming Cell  Development and Bi?potential Commitment  by Neutralizing TGF?β1 In Vitro

      Abstract    To study the regulation of TGF?β1 on the development of hemangioblast, embryonic stem cell?derived blast forming cells (BL?CFC)  were used  as the model of hemangioblast in vitro. TGF?β1 or anti?TGF?β1 neutralization antibody was added in the medium of embryoid body (EB) generation  for observating influence of TGF?B1 addition in different culture stages on number of BL?CFC and differentiation of BL?CFC to endothelial  and hematopoietic cells.  The results showed  that antagonizing TGF?β1 in the course of EB growth could significantly reduce the number of BL?CFC (P<0.01), and  the frequency of Flk?1+ cells was also decreased consistently. Furthermore, the BL?CFC derived from EB pretreated with TGF?β1 demonstrated remarkably elevated hematopoietic and endothelial potential, whereas such bi?potential was impaired in the group with neutralizing antibody.  It is concluded that  TGF?β1, a conventional negative regulator in hematopoiesis and angiogenesis  exert positive effects on the development and differentiation capacities of BL?CFC in vitro.

    Key words    TGF?β1； BL?CFC； embryonic stem cells

      胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC) 来源的BL?CFC (blast?colony forming cell) 的检测是研究成血血管细胞(hemangioblast)的主要体外模型，已经为阐明某些转录因子和细胞因子在成血血管细胞发育中的调控作用提供了有效的途径［1,2］。普遍的观点认为，TGF?β1是成体造血和内皮细胞增殖的抑制因子；TGF?β1－/－小鼠卵黄囊造血和内皮系统的发育异常也表明其在胚胎早期发育中对于中胚层细胞分化、卵黄囊血管发生极为重要。此外，TGF?β1可体外诱导鸟类体壁中胚层细胞分化的同时产生造血和内皮细胞，提示其在成血血管细胞发育中具有重要作用。最近的研究证明，TGF?β1信号通路下游分子Smad5基因敲除的ESC中BL?CFC数量明显高于野生型［3］。因此，TGF?β1对成血血管细胞发育的调控值得深入研究。

    材料和方法

    细胞因子及抗体

    重组人血小板生成素(rhTPO)、小鼠碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、小鼠血管内皮生长因子(VEGF)、小鼠干细胞因子(SCF)、小鼠白介素－3 (IL?3)、 重组人白介素?11 (rhIL?11)、 小鼠粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子(GM?CSF)）、小鼠胰岛素样生长因子(IGF?1)均为PeproTech公司产品。小鼠白血病抑制因子(mLIF)为Chemicon公司产品。重组人促红细胞生成素(rhEpo)为日本麒麟啤酒株式会社产品。TGF?β1和Anti?TGF?β1中和抗体实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(2)拮抗TGF?β1可抑制胚胎干细胞来源BL?CFC的产生和分化购自R&D 公司。大鼠抗小鼠血管内皮钙黏蛋白(VE?Cadherin)单克隆抗体、大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体均为PharMingen公司产品。FITC标记的羊抗大鼠二抗为Santa Cruz公司产品。

    ESC培养

    DMEM、IMDM、胎牛血清、L?谷氨酰胺、非必需氨基酸、胰蛋白酶均为Hyclone公司产品。硫代甘油(MTG)为Sigma公司产品。无蛋白杂交瘤培养基II (PFHM II) 购自Gibco?BRL公司。

    小鼠ESC系（CCE）［4,5］由StemCell Technologies公司惠赠。应用Co60照射后的小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层进行ESC的维持培养［6］。维持培养体系组成为： DMEM、15%胎牛血清、2 mmol/L L?谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 μmol/L 硫代甘油及mLIF 1 000 U/ml。

    ESC分化形成拟胚体

    用0.25%的胰蛋白酶消化CCE获得单细胞悬液后以2.5×104个细胞/60 mm细菌培养皿(Greiner公司)的密度种入拟胚体(embryonic body, EB)培养体系。体系组成： IMDM、 15%胎牛血清、0.9%甲基纤维素、450   μmol/L MTG、5% PFHM II、2 mmol/L L?谷氨酰胺。不同的实验组分别加入TGF?β1(2 ng/ml)和Anti?TGF?β1中和抗体。培养条件为37℃、5%  CO2，饱和湿度。

    BL?CFC培养

    收集培养第3天的EB，经0.25%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液，以5×104/ml的细胞密度种入35 mm细菌培养皿中(Greiner)。CFU?BL(blast?colony forming unit)集落培养体系为： IMDM、10%胎牛血清、0.9%甲基纤维素、450 μmol/L MTG、25 μg/ml抗坏血酸(Sigma)、200 μg/ml转铁蛋白(Sigma)、2 mmol/L L?谷氨酰胺、5 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、20 ng/ml TPO。培养6?7天后观察和鉴定BL?CFC形成的CFU?BL集落。显微镜下挑取单个集落种入液体扩增体系。此体系组成为： IMDM、10%胎牛血清、10%马血清(Hyclone)、2 mmol/L L?谷氨酰胺、450 μmol/L MTG、50 ng/ml SCF、10 ng/ml IL?3、10 ng/ml IL?11、5 ng/ml VEGF、6 U/ml EPO、10 ng/ml bFGF、10 ng/ml IGF?1。培养条件同上。

    流式细胞术检测

    同上方法收取培养第3天EB细胞，用100 μl PBS重悬细胞，加入2 μl大鼠抗小鼠Flk?1抗体(eBioscience产品)，室温避光反应30分钟，用PBS清洗2次，每次300×g离心10分钟，加入2  μl  PE标记的羊抗大鼠二抗(Southern Biotechnology Associates, Inc产品)，室温避光反应30分钟，PBS清洗2次后用流式细胞仪检测。

    造血祖细胞集落培养

    收集单个CFU?BL集落来源的非贴壁细胞种入造血祖细胞集落培养体系，IMDM含15%胎牛血清、0.9%甲基纤维素、450 μmol/L MTG、200 μg/ml转铁蛋白、2 mmol/L L?谷氨酰胺、50 ng/ml SCF、10 ng/ml IL?3、10 ng/ml IL?11、20 ng/ml TPO、6 U/ml EPO。培养条件同上。

    免疫荧光染色

    上述液体扩增体系中去除非贴壁细胞后，贴壁细胞继续在含有5 ng/ml VEGF、10 ng/ml bFGF、10 ng/ml IGF?1的培养液中培养1?2周。对贴壁细胞进行VE?Cadherin和CD31免疫荧光标记，操作按公司提供的说明书进行。

    DiI?Ac?LDL吞噬实验

    在上述含有贴壁细胞的培养基中加入10 μg/ml DiI?Ac?LDL (Biomedical Technologies产品)，37℃ 孵育4小时后用PBS清洗数次，置荧光显微镜下观察。

    实验分组

    实验分为5组，具体见附表。

    统计学分析

    Student  t检验，P值小于0.05具有统计学意义。

    结    果

    EB培养阶段拮抗TGF?β1可抑制BL?CFC的产生

    ESC在半固体培养基中自发分化形成具有三胚层细胞的EB，EB中的BL?CFC在VEGF和SCF存在的培养体系中产生典型形态的“CFU?BL”集落。

    检测结果表明：在EB培养中加入TGF?β1的T?EB组与正常组相比BL?CFC均数略高， t检验P=0.7109，无统计学差异；加入Anti? TGF?β1 抗体的Ab?EB组的BL?CFC数目较正常组显著降低(P=0.0058，图1)。

    Figure 1. Influence of TGF?β1 and anti? TGF?β1 antibody on the number and colony formation of BL?CFC. **P<0.01， compared with control.

    TGF?β1抑制CFU?BL集落生长

    如图1所示，在CFU?BL集落培养体系中加入TGF?β1可明显抑制CFU?BL集落的生长 (P=0.0014)，而加入Anti? TGF?β1并不改变BL?CFC的数目。

    TGF?β1可增加EB中Flk?1+细胞的比例

    分别收集正常组、T?EB组和Ab?EB组培养第3天EB细胞，流式细胞术检测Flk?1+细胞比例，T?EB组Flk?1+细胞比例有所升高，而Ab?EB组则为降低(图2)。

    Figure 2. Influence of TGF?β1 and anti? TGF?β1 antibody on the frequency of Flk?1 positive cells.

    EB形成过程中TGF?β1可增强BL?CFC的造血和内皮分化能力

    按照已建立的BL?CFC造血和内皮分化能力的鉴定方法［6］，各组CFU?BL集落细胞进行造血细胞集落培养，并统计CFU的数量。T?EB组中单个CFU?BL集落产生的造血细胞集落数量显著高于正常组，而Ab?EB组CFU数量明显降低（图3）。为研究TGF?β1对 BL?CFC内皮细胞分化能力的影响，我们统计了各组可产生内皮细胞的CFU?BL集落的比例。结果表明，Ab?EB组的比例较正常组有明显的下降（图4）。

     讨    论

    TGF?β1作为造血负调控因子，主要是通过抑制处于静止期的早期造血干祖细胞进入分裂期，从而选择性和可逆性地抑制造血组织中早期细胞的增殖。然而，TGF?β1在整个造血调控中的作用却极为复杂，不同时期不同发育阶段的细胞群体对TGF?β1的反应性不尽相同。在体外TGF?β1明显抑制骨髓中早期造血祖细胞如HPP?CFC的数量，但并不影响晚期造血细胞集落的数目。TGF?β1－/－小鼠并没有出现造血细胞的增多，反而使红细胞减少，同时出现内皮细胞分化异常。TGF?β1及其受体缺陷的小鼠无一例外都同时影响到造血和血管内皮系统的发育，提示TGF?β1在成血血管细胞发育阶段具有重要作用。

    在EB培养阶段加入TGF?β1并不影响BL?CFC的数量，但加入TGF?β1中和抗体则使BL?CFC的数量明显下降，显示出血清中或EB细胞自身分泌的内源性TGF?β1可促进EB细胞分化产生BL?CFC。这与报道［7］TGF?β1可体外诱导体壁中胚层细胞分化同时产生造血和内皮细胞的结果相符。研究表明，Flk?1可作为成血血管细胞表面标志［1］，因此为了验证TGF?β1对EB细胞产生BL?CFC的促进作用，同时观察了TGF?β1对EB细胞产生Flk?1＋细胞的作用，得到了与BL?CFC相一致的结果： TGF?β1可促进EB细胞分化产生Flk?1＋细胞，TGF?β1中和抗体则相反。

    此外，TGF?β1的中和抗体在EB培养阶段不但减少BL?CFC的数量，同时可影响BL?CFC的分化能力。单个CFU?BL集落获得的造血细胞中CFU的含量在T?EB组中较正常组高，Ab?EB组则相反。CFU的增加说明了TGF?β1对BL?CFC造血细胞分化能力的促进。同样，Ab?EB组CFU?BL集落中具有内皮细胞分化能力的集落所占的比例明显低于正常组，说明Ab?EB组BL?CFC内皮细胞分化能力的降低。以上各组的差别在于EB培养阶段是否加入TGF?β1或TGF?β1的中和抗体，而在CFU?BL集落培养阶段培养体系与正常组完全相同，这就提示TGF?β1在促进EB细胞分化产生BL?CFC的同时也在一定程度上提高了其向造血和内皮细胞分化的能力。TGF?β1基因敲除小鼠胚胎表现为内皮细胞的分化异常和卵黄囊中红细胞的减少，但无法确定内皮细胞的分化异常是在其终末分化时因TGF?β1的缺失而发生异常，还是在内皮细胞从中胚层分化产生之初因TGF?β1的缺失而其后的分化受到影响。TGF?β1对BL?CFC造血和内皮细胞分化的能力的影响的结果提示，TGF?β1对中胚层细胞诱导分化产生成血血管细胞的同时就决定了其向造血和内皮细胞分化的能力。

    外源性加入的TGF?β1在Blast集落培养阶段几乎完全抑制CFU?BL集落的生长。最近的研究也证明，TGF?β1可抑制VEGF介导的内皮细胞和造血细胞的扩增［8］，提示TGF?β1对CFU?BL集落生长的抑制可能是其抑制内皮和造血细胞扩增的结果。

    值得注意的是， TGF?β1在BL?CFC产生前后调控作用的不同，在EB分化产生BL?CFC过程中表现为促进作用，而在BL?CFC形成CFU?BL集落过程中则为抑制。此现象提示TGF?β1对成血血管细胞发育的调控在其产生前后有着严密而精细的调节方式和机理。因此，阐明TGF?β1在成血血管细胞发育中的调控作用及其机理是非常有趣而复杂的课题。

【文献】
  1Faloon P, Arentson E, Kazarov A, et al. Basic fibroblast growth factor positively regulates hematopoietic development. Development, 2000; 127:1931-1941

2Ema M, Faloon P, Zhang WJ, et al. Combinatorial effects of Flk?1 and Tal1 on vascular and hematopoietic development in the mouse. Genes Dev, 2003; 17:380-393

3Liu B, Sun Y, Jiang F, et al. Disruption of Smad5 leads to enhanced proliferation of high proliferative potential precursors during embryonic hematopoiesis. Blood, 2003; 101: 124-133

4Anagnostou A, Liu Z, Steiner M, et al. Erythropoietin receptor mRNA expression in human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1994; 91:3974-3978

5Fina L, Molgaard HV, Robertson D, et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood, 1990; 75:2417-2426

6要晖宇，刘兵，原野等. 胚胎干细胞来源的BL?CFC可产生高增殖潜能造血祖细胞. 实验血液学杂志, 2003; 11:345-349

7Pardanaud L, Dieterlen?Lievre F. Manipulation of the angiopoietic/hemangiopoietic commitment in the avian embryo. Development, 1999; 126:617-627

8Park C, Afrikanova I, Chung YS, et al. A hierarchical order of factors in the generation of FLK1? and SCL?expressing hematopoietic and endothelial progenitors from embryonic stem cells. Development, 2004; 131:2749-2762