干扰素α?2b对HL?60细胞抑增殖与促凋亡的影响

【摘要】  为了研究干扰素α?2b（IFNα?2b）对HL?60细胞增殖与凋亡的影响，采用瑞氏染色观察HL?60细胞的形态变化，吖啶橙/溴化乙锭双染色观察细胞凋亡，通过CD13测定观察细胞膜抗原表达及成熟分化，MTT实验观察增殖活性。结果显示：加入IFNα?2b 48小时后，HL?60细胞凋亡率升高，增殖活性下降，而且随着IFNα?2b浓度的升高，抑制作用更加明显。CD13表达逐渐下降，细胞形态逐渐向成熟转化。结论：IFNα?2b 能促进HL?60细胞凋亡、抑制HL?60细胞增殖和促进分化成熟。

【关键词】  干扰素 干扰素α?2b HL?60细胞 细胞凋亡 细胞增殖

    Influence of Interferonα?2b  on Proliferation  Inhibition  and Apoptosis Induction in  HL?60 Cells

       Abstract    To investigate the effects of interferonα?2b on proliferation and apoptosis in  HL?60 cells,  HL?60 cells were cultured in different concentrations of IFNα?2b. The morphologic  changes were observed by  Wright′ s and acridine orange (AO) and ethidium bromide (EB) staining respectively. Inhibition of proliferation was detected by MTT.  Expression of CD13+ was checked by indirect fluoroimmunoassay. The results showed that apoptosis rate of HL?60 cells  assayed by the above?mentioned two methods was (51±2)% and (78±3)% respectively and OD570 values of proliferation inhibited were 1.8±0.1 and 1.0±0.1 respectively when the concentrations of the IFNα?2b were 500 and 10 000 U/ml in culture for 48 hours. Morphology and count of CD13+ cells were  changed. CD13+ cell  expression rate was (62±2)% and (30±3)% respectively when the concentrations of the IFNα?2b were 500 and 10 000 U/ml in culture for 48 hours.It is concluded that IFNα?2b can enhance the apoptosis of HL?60 cells, inhibit their proliferation,  promote their  maturation and differentiation.

    Key words    interferon;  interferonα?2b;   HL?60 cell; apoptosis;  cell proliferation;

    目前，对急性白血病的已从既往的化学治疗、放射治疗到诱导分化治疗、生物及免疫治疗、靶向及基因治疗和造血干细胞移植治疗,患者的完全缓解(CR)率、无病生存(DFS)率和总生存(OS)率明显提高,但仍有部分患者复发。微小残留病（MRD）是复发的主要原因之一。研究表明,干扰素（IFN）对某些白血病、实体瘤有较好的疗效［1-3］，可使耐药的白血病细胞发生耐药逆转，但其作用机制尚不明了。为此，本实验以人类早幼粒细胞白血病系（HL?60）为对象，探讨IFN体外对HL?60细胞的影响，为INF作为白血病的辅助治疗提供理论依据。

    材料和方法

    细胞和主要试剂

    HL?60细胞系由山东省医学院基础医学研究所提供。干扰素α?2b购自Megagene公司，FITC?兔抗鼠Ig工作液（CatEK001）和CD13抗人单克隆抗体工作液（Cat.DK013Y）购自协和干细胞基因工程有限公司，RPMI 1640培养液是美国Gibco BRL公司产品，四甲基偶氮唑蓝法（MTT） 、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）、瑞氏（Wright）染色剂是美国Sigma公司产品。

    细胞培养

    HL?60白血病细胞在含10 %新生牛血清的RPMI 1640培养液中，于5%  CO2、37 ℃条件下悬浮培养, 2-3天传代1次。

    实验分组

    取对数生长期的HL?60 细胞， 调整细胞浓度为 1×106/ml，0.1%台盼蓝鉴定活性在98%以上。实验分为对照组（A）和实验组（B、C、D、E、F），在24孔培养板中，每孔加入1 ml细胞悬液。每组设4个复孔。各实验组中再加入IFNα?2b溶液50 μl，终浓度分别为500、1 000、2 000、5 000、10 000 U/ml，对照组加入等量生理盐水。于37℃、5% CO2条件下培养48小时。

    细胞增殖实验

    每孔取细胞悬液200  μl加入96孔板，每孔加入MTT溶液20 μl，37 ℃孵育4小时。吸去上清液，每孔加入150 μl二甲亚砜（DMSO），振荡10分钟，570 nm用酶标仪测定各孔的吸光度。

    细胞形态及凋亡检测

    在普通光学显微镜下观察各组细胞形态的变化。另取各组细胞分别加入吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合染液，混匀2分钟后滴在载玻片上，加盖玻片后在普通光学显微镜下计数200个细胞，在荧光显微镜下计数凋亡细胞，凋亡率。对凋亡细胞的结果判断为：活HL?60细胞核染色质呈均匀一致的绿色，呈正常结构；早期凋亡细胞核染色质着绿色，呈固缩状；晚期凋亡细胞核染色质着橘红色，呈固缩状；死亡细胞核染色质着橘红色，呈正常结构。

    CD13蛋白表达的测定 

    每孔取细胞悬液50 μl加入鼠抗人CD13单克隆抗体50  μl，混匀。于4℃孵育40分钟。用PBS洗2次，加入FITC标记的兔抗鼠单克隆抗体50 μl，混匀。于4℃孵育40分钟。用PBS洗2次，留沉淀细胞和10-20 μl上清液，混匀。吸取1滴细胞悬液滴于载玻片上，加盖玻片。用普通投射光计数视野中的细胞数，然后用紫外光计数同视野中荧光阳性的细胞，共计数200个细胞，阳性细胞的百分数。

    统计学处理

    利用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析，所有数据用±SD表示。组内采用方差分析，组间采用t检验。

    结    果

    IFNα?2b对HL?60细胞增殖活性的影响 

    不同浓度的IFNα?2b在48小时内对HL?60细胞的活力无明显影响（台盼蓝染色细胞活力95%以上）。MTT法检测显示，IFNα?2b对HL?60细胞生长具有抑制作用，随着浓度升高，对HL?60细胞的抑制作用加强，OD值降低，在浓度为1 000  U/ml时开始产生明显抑制作用，浓度为10 000 U/ml时抑制作用最明显（附表）。

    IFNα?2b对HL?60细胞形态学及凋亡的影响

    当IFNα?2b浓度为1 000 U/ml时，细胞开始出现形态的变化，当浓度≥2 000 U/ml时，细胞核明显缩小，核仁消失，胞浆由少变多，核浆比缩小，核偏于一侧，有凹陷，分叶明显。IFNα?2b浓度为500 U/ml时及对照组细胞形态未见变化。

    当IFNα?2b浓度为500 U/ml时，HL?60细胞凋亡率为(51.4±1.8)%，以早期凋亡细胞为主；随着IFNα?2b浓度的升高，HL?60细胞的凋亡率逐渐升高，以F组升高最明显，高达(77.6±3.4)%，以晚期凋亡细胞为主；而对照组HL?60细胞凋亡率仅为（18.5±2.1)%（附表）。

    HL?60细胞CD13蛋白的表达

    对照组HL?60细胞CD13阳性表达率为(65.8±4.2)%，随着IFNα?2b浓度的升高，实验组的CD13阳性细胞表达率逐渐降低，以F组降低最明显，为(29.8±2.5)%，明显低于对照组和其他实验组（附表）。

    讨    论

    干扰素（IFN）是一类具有广泛生物活性的蛋白质，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用，是人体防御系统重要的细胞因子。目前已用于临床的IFN有α、β、γ 3种类型。IFNα?2b具有干扰多种正常或恶性细胞增殖的作用［4］。本研究发现，当IFN浓度为1 000 U/ml时，对HL?60细胞增殖有明显的抑制作用，随浓度增加，抑制作用逐渐增强，提示IFN能直接抑制肿瘤细胞增长，其作用机制尚不清楚。已有研究表明，IFN体外可促进单核细胞白血病细胞诱导分化［5］。本实验也显示INF有促进HL?60细胞分化成熟的作用，当浓度为1 000 U/ml时，即出现HL?60细胞形态的变化，当浓度≥2 000 U/ml时，细胞核明显缩小，核仁消失，胞浆由少变多，核浆比缩小，核偏于一侧，有凹陷，分叶明显。同期表达CD13+细胞的数量也下降,而HL?60细胞的活力正常，这提示经IFN作用后，HL?60细胞不仅发生形态学变化，而且出现细胞膜抗原表达的变化。干扰素还可以诱导多种肿瘤细胞凋亡［6］。引起凋亡的机理可能与下调C?myc、Bcl?2表达，上调Bax表达和诱导Fas配体表达增加有关。本研究发现，IFN有明显促进HL?60细胞的凋亡的作用，当浓度为500 U/ml时，细胞核染色质就开始出现少量的凝集，5 000 U/ml时核染色质就开始呈橘红色并出现固缩，呈现晚期凋亡细胞形态。

    干扰素在体外不仅对HL?60细胞有明显抑制增殖的作用，而且有促进诱导分化的作用和促进细胞凋亡的作用，因此干扰素的应用有望成为急性白血病完全缓解后微小残留病的主要途径。其作用机制有待进一步研究。

【】
  1孙立荣，庞秀英，李学荣等.维甲酸联合干扰素治疗IV期神经母细胞瘤的近期疗效观察.中华血液学杂志,2002;23:104

2孙立荣，庞秀英，卢愿等.干扰素α?2b瘤内注射治疗儿童难治性实体瘤的近期疗效观擦.中华儿科杂志, 2003; 41: 374-375

3Guilhot F, Maloisel F, Guerici A. Update of the 810 chronic myelogeneous leukaemia patients treated with interferon α?2b and interferon α?2b with cytosine rabinoside.Br J Haematol,1998;102:282

4李振.恶性肿瘤的化学治疗与免疫治疗.北京：人民卫生出版社,1990:355-356

5 陈慧仁，孙关林，韩锐等. 新维甲酸联合γ干扰素对急性单核细胞性白血病细胞增殖分化作用的体外研究.中华血液学杂志，1999;20:10-13

6Minami R, Muta K, Ilesung C,et al. Interleukin?6 sensitizes multiple myeloma cell lines for apoptosis induced by interferon? α. Exp Hematol,2000;28:244-255??