新的HLA-B*4061等位基因的核苷酸序列分析
作者：章伟 吕沁风 王炜 韩浙东 朱发明 严力行
【摘要】 本研究探讨HLA 新的等位基因HLA-B*4061的分子基础。采用盐析法抽提样本DNA，利用PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第1-8外显子，PCR产物直接经TOPO克隆到质粒载体中得到单链，对所得克隆进行HLA-B基因第2、3、4外显子双向测序分析。应用PCR-SSP方法证实测序所发现的突变。结果表明：先证者样本克隆测序得到2个等位基因，其中1个等位基因为B*4601，另1个经blast验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ089628，DQ089629，DQ089630）。与最接近的B*400101等位基因序列相比，新的等位基因仅在第2外显子上有1个核苷酸不同，即第272位C→A，导致第67位氨基酸Ser→Tyr。结论：HLA-B*4061等位基因为新的HLA-B等位基因，已荣获世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名。
【关键词】 HLA-B；HLA-B*4061； 等位基因；序列分析
Sequence Analysis of HLA-B*4061 Allele Newly Found
AbstractThe aim of this study was aimed to investigate the molecular genetic basis for a novel HLA allele, HLA-B*4061, in Chinese population. DNA was extracted from whole blood by salting-out method. The HLA-B exons 1-8 of the proband was amplified and the amplified product was cloned using TOPO TA cloning sequencing kit to split the two alleles apart. Both strands of exons 2, 3 and 4 of chosen colonies were sequencing. The PCR-SSP was performed to confirm the mutations detected by sequencing. The sequencing results showed HLA-B alleles of the proband as B*4601 and the novel allele. The sequences of the novel allele have been submitted to GenBank (DQ089628，DQ089629，DQ089630). After HLA blast analysis, the novel allele showed a single nucleotide mismatch with B*400101 in exon 2 at position 272 C→A, as the results, changing amino acid from Ser to Tyr at codon 67. It is concluded that this allele is a novel one and has been officially named B*4061 by the WHO Nomenclature Committee.
Key wordsHLA-B；HLA-B*4061; allele; sequence analysis
人类白细胞抗原（HLA）在器官移植和造血干细胞移植中起重要的作用，HLA抗原相容能显著改善移植物的存活，目前HLA的DNA分型已广泛应用于造血干细胞移植、肾移植等。HLA系统是目前所知最具多态性的系统，现已命名的HLA等位基因超过2 000个，并且仍不断在发现新的等位基因［1-3］。本实验室在检测的造血干细胞捐献者样本中发现1例新的HLA-B等位基因，被世界卫生组织（WHO）HLA命名委员会正式命名为HLA-B*4061，现将结果报告如下。
材料和方法
样本来源
先证者为男性，浙江籍汉族，为造血干细胞捐献者，在本实验室HLA常规分型中因HLA-B位点出现罕见的反应格局而进一步确认。
样本DNA提取
按快速盐析法［4］。
HLA分型
HLA-A、-B、-DRB1基因分型采用PCR-SSO方法（tepnel lifecodes, stamford,CT），严格按试剂说明书进行操作，结果采用自动软件判读。HLA-A、-B血清学分型采用PEL-FREEZ公司的试剂盒进行操作。
HLA-B基因2-4外显子测序分析
PCR扩增引物参照 HLA-B 基因序列设计， 由上海申能博彩公司合成，扩增引物序列为5′ GGCAGA CAGTGTGACAAAGAGGC 3′ 和5′ CTGGGGAGG AAACACAGGTCAGCATGGGAAC 3′ 。扩增反应体系总体积为100 μl，其中含10×PCR缓冲液 10 μl，样本DNA 200-400 ng，LA TaqDNA聚合酶4.0 U；dNTP、MgCl2终浓度分别为0.2 mmol/L、1.25 mmol/L，引物终浓度为0.2 μmol/L。用PE公司的9700型PCR自动扩增仪扩增，扩增条件为95℃预变性5分钟，95℃ 30秒，67℃ 45秒，72℃ 3分钟30秒，35个循环，72℃延伸10分钟后冷却至4℃。
TOPO克隆将PCR扩增产物严格按试剂（Invitrogen产品，美国）说明进行克隆。PCR产物首先与pCR4@TOPO质粒载体连接后转染大肠杆菌，接种LB平板，37℃培养过夜，从中挑选出数个克隆扩增细菌并提取质粒，质粒DNA经酶切证实为阳性克隆后进行测序鉴定。
序列分析以重组质粒为模板按BigDye Sequencing kit（ABI公司）试剂盒操作进行测序反应，测序引物参照［5］。采用乙醇/醋酸钠法（终浓度分别为66%和0.083 mol/L）纯化测序PCR产物。纯化产物经热变性速冷上ABI PRISM 377测序仪进行PAGE电泳，Sequence Analysis和MT Navigator软件进行数据分析。
B*4061等位基因的序列特异性引物PCR（PCR-SSP）检测
采用引物5′ GGCTACGTGGACGACACGCT 3′ 和5′ AGTCTGTGTGTTGGTCTTGT 3′ 特异性扩增B*4061等位基因。PCR扩增总反应体积为25 μl，其中含10×PCR缓冲液2.5μl，样本DNA 50-100 ng，TaqDNA聚合酶1.0 U；dNTP、MgCl2终浓度分别为0.2 mmol/L、1.6 mmol/L，引物终浓度为0.5 μmol/L。用ABI公司的9700型自动扩增仪扩增，条件为95℃预变性5分钟，95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒，30个循环，72℃延伸10分钟后冷却至4℃。取扩增后标本8 μl，在含0.5 mg/L溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳40分钟，紫外照射仪上观察结果。
结果
HLA分型结果
本例样本基因分型HLA-A和DRB1位点可清楚指定为HLA-A*0207,1101；DRB1*090102，-；HLA-B位点反应格局呈现异常格局，不能最终指定HLA-B等位基因。先证者样本HLA-A、-B位点血清学特性为HLA-A*02，11；HLA-B*46，60。
先证者HLA-B基因2-4外显子序列分析
样本PCR扩增后经TOPO克隆，挑取出7个阳性克隆，经测序分析得到2个等位基因。其中有3个阳性克隆序列一致，为B*4601等位基因；有4个阳性克隆其序列完全一致，经blast验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ089628， DQ089629，DQ089630）。经HLA blast验证与最接近的B*400101等位基因序列相比，新的等位基因仅在第2外显子上有1个核苷酸不同，即第272位C→A（附图），导致第67位氨基酸Ser→Tyr。该新的等位基因已被世界卫生组织（WHO）HLA命名委员会正式命名为HLA-B*4061。
PCR-SSP结果
采用建立的PCR-SSP方法进行检测，在对200名随机献血者的检测中,未发现其他带有B*4061基因的个体。
讨论
HLA复合物位于第6号染色体短臂21.3区域，是调控人体特异性免疫应答的主要基因系统，是目前所知的最富多态性的遗传系统。HLA复合体包括多个基因座位，大多数座位上有多个等位基因，目前仍不断发现新的等位基因［1-3］。HLA基因可分为3类：HLA-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类，每一类均含有多个座位。HLA-B基因属于经典HLA-Ⅰ类，目前发现的HLA-B等位基因已超过700个(http://www. ebi.ac.uk/imgt/hla)。本例新的等位基因HLA-B*40来源于造血干细胞捐献者，其HLA-B位点存在新的HLA-B*40等位基因。HLA-B40抗原分解物为HLA-B60和HLA-B61。研究表明，HLA-B60抗原在白种人中频率为0.04，黑人0.02，日本人0.06，汉人为0.14。HLA-B61抗原在白种人频率为0.02，黑人0.004，日本人0.08，中国汉人0.03。至今已经检出58个与B*40相关的等位基因，中国人群中最常见的为HLA-B*4001，B*4002,B*4003, B*4006［6］。本次发现的是第58个HLA-B*40等位基因，血清学特性显示为HLA-B60。本实验中我们设计了PCR-SSP方法检测B*4061，在随机的200份样本中未发现其他带有B*4061基因的个体，表明该等位基因在中国人群中的频率很低。目前HLA的DNA分型已广泛应用于临床移植配型，常见的方法有PCR-SSP、正向PCR-SSO、反向PCR-SSO，PCR-SBT等。由于PCR-SSP或PCR-SSO分型方法均基于已知的DNA序列进行设计，存在一定的不足，可能错误判断部分罕见的位点，特别是新等位基因。新的等位基因在常规的DNA分型方法中可能出现一些模棱两可的分型结果，表现为依照试剂分型格局判断可能出现多条带或少条带、探针的多余或缺少、不同方法结果的不一致、Bw4或Bw6关联不一致等，最终不能明确指定结果，这在常规的分型工作中应引起重视，避免分型结果错误。
【】
1 Yan LX, Zhu FM, L QF, et al. Identification of HLA-B*5136 in the Chinese population. Tissue Antigens, 2005; 65: 280-282
2 Yan LX, Zhu FM, L QF, et al. Identification of a new HLA-DRB1 allele,HLA-DRB1*1212 and comfirmation of HLA-B*1586. Tissue Antigens, 2005; 65: 582-583
3 Marsh SG, Albert ED, Bodmer WF, et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2004. Tissue Antigens, 2005; 65: 301-369
4 朱发明,许先国,洪小珍等. 1例由α1，2岩藻糖基转移酶基因两碱基缺失引起的类孟买型血型.中华医学遗传学杂志，2004；21：215-218
5 朱发明，吕沁风，章伟等. 1例新的HLA-B等位基因B*5614的核苷酸序列分析.中华医学遗传学杂志，2005；22：288-290
6 Middleton D, Hawkins BR, Williams F, et al. HLA class I allele distribution of a Hong Kong Chinese population based on high resolution PCR-SSOP typing. Tissue Antigens, 2004; 63: 555-561
