重组变构人TRAIL联合柔红霉素对白血病细胞诱导凋亡作用及其机制的研究
作者：张学军 温丽 王福旭 罗建民 潘崚 刘小军 杜行严 董作仁 杨世芳
【摘要】 为了研究重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（ recombinanat mutant human TRAIL, rmhTRAIL）单用及与柔红霉素（DNR）联合应用对白血病细胞株U937、K562的诱导凋亡作用及其机制，以正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作对照，采用MTT法检测体外培养的U937、K562白血病细胞株在rmhTRAIL单用和联合DNR作用下增殖的抑制效应；用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测DNR 处理前后白血病细胞TRAIL死亡受体和诱杀受体的mRNA表达水平。 结果表明：rmhTRAIL对白血病细胞株U937、K562有较明显的抑制增殖作用，DNR与TRAIL联合对抑制肿瘤细胞具有协同性，与各药单独使用比较均有显著差异（P<0.05）；经DNR作用后，U937、K562细胞的死亡受体DR4、DR5水平上调，而两种诱杀受体DcR1、DcR2表达未受影响。 结论：在体外rmhTRAIL单用或与DNR联用均能明显抑制白血病细胞增殖，rmhTRAIL与DNR对白血病细胞的杀伤有协同作用，其诱导机制可能与U937、K562细胞死亡受体DR4、DR5表达水平上调有关。
【关键词】 rmhTRAIL；U937细胞；K562细胞；柔红霉素
Combined Effect of Recombinant Mutant Human TRAIL and Daunorubicin in Inducing Apoptosis of Leukemia Cell and Its Mechanism
AbstractThe aim of study was to investigate the combined effect of recombinomt muctant human TRAIL (rmhTRAIL) with daunorubicin (DNR) or alone on K562 and U937 leukemia cell lines and its mechanism. The fibroblasts (MRC-5) of normal-human embryonic lung were used as control cells. After being treated with rmhTRAIL and DNR or only with rmTRAIL, the cytotoxic effect and the apoptosis rate in K562, U937 cells were measured by MTT assay. The expression levels of TRAIL death receptor and TRAIL decoy receptor mRNA in these three cell lines were assayed by semiquantitive RT-PCR befor and after treatment with DNR. The results indicated that K562 and U937 were sensitive to rmhTRIAL. DNR had synergistic inhibitory effect with rmhTRAIL on the growth of K562 and U937 cell lines （P<0.05）. The expression level of DR4 and DR5 mRNA was significantly higher in K562 and U937 with combined treatment of rmhTRAIL and DNR than that in those alone, while the expressions of DcR1 and DcR2 mRNA were not influenced. It is concluded that in vitro, rmhTRAIL alone or in combination with DNR can obviously inhibite the growth of leukemia cell lines and induce cell apoptosis, DNR and rmhTRAIL have a synergistic inhibitory effect on growth of K562 and U937. The mechanism may correlate with the up-regulation of DR4 and DR5 of K562 and U937.
Key wordsrmhTRAIL；U937 cell；K562 cell；daunorubicin
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis- inducing ligand，TRAIL）是新近发现的肿瘤坏死因子超家族成员,可特异性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无明显杀伤作用。野生型TRAIL在稳定性、溶解性及生物活性等方面存在不足，重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（recombinant mutant human TRAIL，rmhTRAIL）是由北京沙东公司对野生型TRAIL结构进行环化变构后的优化产品，弥补了上述不足。我们以正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作对照，检测rmhTRAIL单用及联合柔红霉素 （daunorubicin, DNR） 对人急性单核细胞白血病细胞株U937、人慢粒红白血病变细胞株K562的促凋亡作用，并在mRNA水平分析化疗药作用前后其两种TRAIL死亡受体DR4、DR5（death receptor 4、5）和两种TRAIL诱杀受体DcR1、DcR2（decoy receptor 1、2）表达的变化，探讨rmhTRAIL急性白血病的可能性及其机理，为rmhTRAIL作为新的抗肿瘤生物制剂治疗血液系统肿瘤提供理论依据。
材料和方法
主要试剂
RPMI 1640培养粉、MEM培养粉、TRIzoL试剂、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲亚砜（DMSO）均购自 Gibco公司。新生牛血清为杭州四季清生物公司产品。rmhTRAIL冻干粉由北京沙东生物技术有限公司提供。柔红霉素为意大利S.P.A公司产品。引物由北京赛百盛公司合成。随机引物、M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶均购自美国Promega公司。
细胞株及培养
K562细胞株由本实验室提供，U937细胞株、MRC-5细胞株均引自北京沙东生物技术有限公司。3种细胞均在37℃、5% CO2恒温条件下饱和湿度培养箱中培养，K562、U937细胞株培养液为含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，48小时传代1次；MRC-5细胞株培养液为含10%新生牛血清的MEM培养液，72小时胰酶消化传代1次，均选用对数生长期细胞进行实验。
细胞生长抑制率的MTT检测
单独用药取对数生长期的K562、U937接种于96孔平底培养板，MRC-5用2.5 g/L胰蛋白酶消化，制备单个细胞悬液接种于培养板，均每孔200 μl（终浓度为2×105/ml）。分别各自加入终浓度为8、40、200、1 000 ng/ml的rmhTRAIL、DNR，对照组细胞加等量培养液，每个浓度孔接种3个复孔，培养24小时后加入20 μl MTT（5 mg/ml），培养4小时，377.4×g离心10分钟，弃上清，加入二甲亚砜（DMSO）200 μl，震荡溶解甲月替结晶，酶标仪490 nm测光吸收值（A），细胞抑制率。公式为细胞抑制率=（1-A处理组/A对照组）×100%联合用药对3个细胞组分别加入终浓度为 8、40、200、1 000 ng/ml DNR，然后每个DNR组分别加入rmhTRAIL 8、40、200 ng/ml，每个浓度孔接种3个复孔，孵育24小时后处理，结果的计算同上。
两药协同作用判断标准
采用国内金（正均）氏公式［1］判断rmhTRAIL和DNR化疗药物的联合作用是否具有协同性。公式：Q=EA+B/（EA＋EB－EAEB）。EA 为A药（rmhTRAIL）单独处理的细胞抑制率，EB 为B药（DNR）单独处理的细胞抑制率，EA+B为两药合并处理的细胞抑制率。Q值介于0.85-1.15为单纯相加，介于1.15-2.0为增强，大于2.0为明显增强，介于0.85-0.55为拮抗，小于0.55位明显拮抗。
TRAIL 4种受体mRNA表达的半定量RT-PCR检测
引物设计由北京赛百盛公司合成,序列如下：DR4 (506 bp)：上游5′-CTGAGCAACGCAGACTCGCTGTCCAC - 3′，下游5′-TCCAAGGACACGGCAGAG CCTGTGCCAT-3′；DR5 (502 bp)：上游5′-GCCTC ATGGACAATGAGATAAAGGTGGCT-3′，下游5′-CCAAATCTCAAAGTACGCACAAACGG-3′；DcR1 (612 bp)：上游5′-GAAGAATTTGGTGCCAATGCC ACTG-3′，下游5′-CTCTTGGACTTGGCTGGGTTC ATGTCCTTC-3′；DcR2 (453 bp)：上游5′-CTTTTC CGGCGGCGTTCATGTCCTTC-3′，下游5′-GTTTCT TCCAGGCTTCCCTTTGTA G-3′；β-actin (155 bp)：上游5′-TCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′。
细胞内总RNA的提取将U937、K562、MRC-5分别与200 ng/ml DNR共同孵育24小时后，收集细胞各约2×105个，同时各以未处理过的细胞作对照，用PBS洗2遍。用TRIzoL一步法提取细胞总RNA，在紫外分光光度计下测定吸光度A260/A280值。
cDNA合成取3 μg RNA，37℃中反应1小时、95℃反应5分钟逆转录合成cDNA。
RT-PCR反应取3 μl cDNA于50 μl反应体系进行PCR反应。DR4、DR5、DcR1、DcR2反应条件为95℃变性3分钟；94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸60秒， 40个循环；72℃延伸5分钟。内对照β-actin的扩增条件：94℃变性5分钟；95℃变性60秒，55℃退火60秒，72℃延伸60秒，30个循环；72℃延伸10分钟。
PCR产物的检测和分析上述扩增产物取6 μl在2%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像分析软件系统对电泳条带进行光密度分析，计算各目的基因条带与内对照β-actin产物条带灰度值之比。
统计学分析
采用SPSS 11.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差（X±SD）表示，多组数据比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。
结果
细胞增殖抑制率
单独用药相同时间内，rmhTRAIL随着作用浓度的增加，对K562及U937的细胞生长抑制率呈剂量依赖性增加（P<0.05）（表1）；而对MRC-5细胞的生长抑制率为（10.30±1.28）%-（14.90±2.89）%，在不同浓度rmhTRAIL组间均无明显差异（P>0.05）。DNR对正常细胞和肿瘤细胞均有生长抑制作用，且表现为剂量依赖性，q检验比较组间差异具有统计学意义（P<0.05）。Table 1. Inhibition on K562，U937 and MRC-5 cell lines induced by rmhTRAIL or DNR alone(略)
联合用药rmhTRAIL联合DNR作用于3种细胞,对细胞生长抑制的影响见表2。在K562、U937细胞中联合用药组的抑制率与单独使用rmhTRAIL或DNR组比较皆有显著差别（P<0.05），随着药物作用剂量的增加，两种药物对K562、U937细胞的联合抑制作用呈增强趋势(P<0.05)。用金（正均）氏公式分析显示：在不同浓度两药联用后，K562细胞Q值介于单纯相加与增强乃至明显增强之间（0.98±0.13-2.75±0.18）；U937细胞Q值介于单纯相加与增强之间（0.82±0.12-1.24±0.13）；而MRC-5细胞Q值介于拮抗与单纯相加之间（0.59±0.09-1.01±0.13）（表3）。由此可以看出，对于K562、U937 2种细胞，联合用药均比两者单独用药效果好，而对于MRC-5联合用药无明显的协同效果。Table 2. Inhibitions on three cell lines induced by rmhTRAIL combined with DNR（略）Table 3. Synergistic effects of rmhTRAIL with DNR on K562，U937 and MRC-5 cell lines（略）
RT-PCR检测
处理前3种细胞受体的表达水平检测K562、U937 及MRC-5 3种细胞4种受体mRNA表达水平发现，3种细胞DR4和DR5 mRNA均有表达（图1、2），DR4在K562 表达最高，而DR5在MRC-5 表达最高（表4）。DcR1 mRNA仅在MRC-5较高表达(1.23±0.01)，K562、U937细胞未见表达（图3）。DcR2mRNA在MRC-5较高表达(1.78±0.01)（图 4），在K562、U937细胞表达较低分别为（0.16±0.01、0.31±0.01)（P均﹤0.05）；且DcR2在K562、U937细胞之间表达无差异（P﹥0.05）。
处理后3种细胞受体的表达水平变化3种细胞分别与DNR（200 ng/ml）共同孵育24小时后：K562、U937细胞的DR5 mRNA表达水平均有提高（P﹤0.05），K562的DR4 mRNA表达水平也有提高，两种肿瘤细胞的诱杀受体DcR2表达水平变化无影响（表4）；正常细胞株MRC-5的4种受体表达均未受到DNR作用的影响。Table 4. Expression levels of four rmhTRAIL receptor mRNAs in K562,U937 and MRC-5 (略)
DNR讨论
TRAIL是由Wiley等［2］于1995年新发现的肿瘤坏死因子超家族成员，它广泛表达于多种正常组织和细胞［2，3］，通过与细胞膜上不同受体结合而发挥不同作用。目前已发现了5种受体，分别是DR4、DR5、DcR1、DcR2及可溶性受体（osteoprotegerin，OPG）［4］。其中DR4、DR5是死亡受体，TRAIL与之结合后能诱导细胞凋亡；DcR1、DcR2及OPG是诱杀受体，由于其结构缺乏胞内信号段，与TRAIL结合后细胞不能传递凋亡信号而逃避凋亡。因此，不同于其他肿瘤坏死因子TNF 和Fas 配体 (FasL)对正常组织的非特异性杀伤作用，TRAIL能特异性的诱导肿瘤细胞发生凋亡。已有报道TRAIL在体外可诱导多种实体肿瘤细胞凋亡［5］，同样对血液病恶性肿瘤也有不同程度的促凋亡作用。本实验通过研究证实rmhTRAIL对白血病细胞K562、U937均有较显著的生长抑制作用，且一定浓度范围内呈剂量依赖性。rmhTRAIL对正常细胞株MRC-5仅有轻度的杀伤作用，随着剂量的增加并没有明显影响抑制率，与报道一致。本实验中，我们采用RT-PCR法检测两种血液病肿瘤细胞和一种正常细胞中TRAIL受体mRNA的表达水平，发现死亡受体DR4、DR5在肿瘤细胞和正常细胞株都有不同程度的表达；而诱杀受体DcR1和 DcR2仅在正常组织呈高表达，在肿瘤组织表达较低或不表达。因此，TRAIL对细胞特异性凋亡作用中诱杀受体的表达可能有着更为重要的意义。正常细胞和肿瘤细胞表面诱杀受体表达水平的差异，是TRAIL对其杀伤力不同的一个重要原因。诱杀受体的表达发挥着保护正常细胞逃逸TRAIL杀伤的作用，以及对TRAIL诱导的凋亡进行调控的作用［6］。此外，各受体的表达并不是TRAIL诱导凋亡作用的唯一决定因素，NF-κB的激活、P53的调控、FLIP和凋亡抑制蛋白的表达等多种因素会综合影响TRAIL的凋亡通路。柔红霉素（DNR）是目前临床血液病肿瘤化疗一线用药，但其长期应用可引起严重的心脏毒性及产生耐药性。本研究对白血病细胞株K562、U937联合应用rmhTRAIL和DNR，结果提示联合应用组比各单药组对白血病细胞株的生长抑制率更高、杀伤作用更大。采用国内金（正均）氏公式证实两药联用对K562、U937细胞的促凋亡作用有明显协同性，而这种药物间的协同性在正常细胞株MRC-5并不明显。因此，在协同作用的基础上，联合用药减低了每种药物各自的用药剂量，可减轻药物的毒性和不良反应；且抗肿瘤效果超过单用各药，对于克服肿瘤细胞对药物的耐受性有重要意义。关于化疗药物对TRAIL协同作用机制有多种说法：可通过促进肿瘤细胞表达TRAIL及其相关受体［7］，使TRAIL与死亡受体结合增多，导致白血病细胞凋亡；由于TRAIL和受体结合后，能活化caspase-8，使化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的阈值降低［7］；化疗药物可以下调bcl-2的表达，降低TRAIL诱导凋亡的阈值［8］；化疗药物导致DNA损伤后，诱导p53生成增加，p53能够与DR5的增强子结合，直接调控DR5的表达，通过DR5诱导的凋亡途径调节细胞的凋亡［9］。其中，许多学者认为与TRAIL受体在肿瘤细胞表面诱导性表达有关，即化疗药物可同时诱导DR4、DR5在肿瘤细胞表面大量表达。本实验中，我们检测到K562、U937细胞在经DNR孵育后死亡受体表达水平提高，同时诱杀受体表达水平未受影响；正常细胞株MRC-5的4种受体表达均未受到DNR作用的影响。因此，推测化疗药物可提高肿瘤细胞株的死亡受体DR4、DR5表达水平，可能是两药能协同性诱导凋亡重要机制；两药不能协同诱导正常细胞株MRC-5凋亡，这可能与DNR不能诱导MRC-5的死亡受体表达增高有关。本实验也显示与化疗药的协同作用并没有改变细胞诱杀受体的表达水平。总之，化疗药DNR可通过增强TRAIL死亡受体的表达而产生协同促进细胞凋亡的作用。TRAIL与化疗联合作用的其它机制还有待进一步研究。本研究证实rmhTRAIL对血液肿瘤细胞具有较敏感的选择性诱导凋亡作用，且可与化疗药物DNR发生凋亡协同作用，这种特殊的作用方式给血液病恶性肿瘤的带来了新的思路，其有望成为治疗白血病的新一代生物制剂，具有良好的临床应用前景。
【文献】
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