乳腺癌患者腋下淋巴结来源的DC诱导自体特异性CTL的实验研究

                        作者：刘运江 张建立 单保恩

【关键词】  乳腺癌;,腋窝淋巴结;,细胞因子;,树突状细胞;,特异性细胞毒T淋巴细胞

　　Induction of specific CTL by DC from axillary lymph node of patients with breast cancer

　　[Abstract]  AIM: To investigate the capability of the dendritic cells (DC) from axillary draining lymph node of patients with breast cancer to induce the antigen specific CTL. METHODS: The  mononuclear cells were isolated from axillary draining lymph node, and the adherent cells were cultured with rhGMCSF and rhIL4 to induce DC. The nonadherent cells were cultured with IL2 to induce tumor draining lymph node cells（TDLNC）. DCs stimulated by the autoallergic breast cancer freezethawing antigen were cocultured with  the obtained TDLNC to induce tumor antigen specific CTL. RESULTS: The positive percentage of CD1a, CD83, CD86 on DC from freshly isolated mononuclear cells in axillary draining lymph node was 110±23, 266±52 and 330±61, respectively. After cocultured with rhGMCSF, rhIL4, breast cancer freezethawing antigen and TNFα, the percentageof CD1a、CD83、CD86wasincreased to 502±57, 605±165 and 562±164,  respectively, (P<001). The percentage of CD8+ T cells in TDLNC increased from 328±32 to 625±25 after cocultured with DCAg (P<001). CONCLUSION: Typical DCs can be induced from the mononuclear cells in  axillary draining lymph node after stimulated with cytokine (rhGMCSF, rhIL4 and TNFα), which possess strong antigen presentation function and can stimulate TDLNC to proliferate and differentiate into antigen specific CTL.

　　[Keywords]breast cancer; axillary lymph node; cytokine; dendritic cell; specific CTL

　　[摘 要]  目的: 研究乳腺癌患者腋下淋巴结单个核细胞来源的树突状细胞（DC）诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）的能力。方法: 以多种细胞因子联合诱导腋下淋巴结单个核细胞中的贴壁细胞为DC, 非贴壁细胞与IL2共培养后诱导成为肿瘤区域引流淋巴结细胞（TDLNC）, 用自体乳腺癌细胞冻融抗原刺激DC, 并和TDLNC共培养, 以诱导肿瘤抗原特异性CTL。结果: 淋巴结细胞经体外培养后, 贴壁细胞在DC诱导前, 其特异性表面标志物CD1a、 CD83、 CD86的百分比（%）分别为110±24、 266±52和330±61, 经与rhGMCSF、 rhIL4共同培养, 并经自体肿瘤冻融抗原加TNFα诱导后3种标志物的水平升高, 其百分比（%）分别为502±57、 605±165和562±164(P<001)。TDLNC中CD3+和CD8+细胞含量（%）分别为739±22 和 328±32; 经DC和肿瘤抗原诱导后, DCAgTDLNC 中的CD3+和CD8+细胞含量升高, 其百分比（%）分别为827±28 和625±25(P<001)。结论: 乳腺癌患者腋下引流淋巴结中的单个核细胞在 rhGMCSF 和rhIL4刺激活化和自体肿瘤抗原及TNFα的诱导下, 可以分化为典型的 DC。成熟的DC具有较强的抗原提呈功能, 可以促进TDLNC增殖、 分化为抗原特异性CTL。

　　[关键词]乳腺癌; 腋窝淋巴结; 细胞因子; 树突状细胞; 特异性细胞毒T淋巴细胞
   
　　近年来, 乳腺癌的发病率已占女性恶性肿瘤的首位。虽然经手术、 放疗、 化疗等综合, 乳腺癌的远期生存率有了较大提高, 但仍有部分患者因广泛转移, 造成治疗失败, 甚至死亡。生物治疗是近年来迅猛的又一重要治疗手段。由于树突状细胞（dendritic cell, DC）在抗原提呈中的关键性作用, DC肿瘤疫苗已成为乳腺癌生物治疗研究最活跃的领域之一。然而, 乳腺癌患者体内循环中及肿瘤局部的DC均存在功能缺陷[1], 因此, DC的诱导和功能鉴定是DC肿瘤疫苗制备过程中关键的一步。我们对乳腺癌患者腋下引流淋巴结单个核细胞经rhGMCSF、 rhIL4和TNFα诱导成为DC, 再以肿瘤抗原负载DC, 刺激从腋下引流淋巴结中分离并以rhIL2诱导的细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T cell, CTL）, 并检测其细胞表型的变化, 以期建立一种新的DC来源的方法。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  选取200511/20062在河北医科大学第四外一科住院手术的女性乳腺癌患者5例, 年龄41~67岁, 平均53.6 岁, 病理均为乳腺浸润性导管癌。RPMI1640培养基购自 Promega公司, rhGMCSF、 rhIL2、 rhIL4 购自Cytolab公司, 抗CD1a、 CD83、 CD86 单克隆抗体(mAb)购自Biolegend公司, 抗CD3 mAb和抗CD4、 CD8 二联抗体购自Coulter公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  自体乳腺癌细胞抗原的制备  术中无菌切取乳腺癌周边生长旺盛的肿瘤组织约3 cm3, 剪成1 mm3大小, 用含0.5 g/L Ⅱ型胶原酶的RPMI1640培养基, 37℃消化3 h, 200目钢网过滤, 收取细胞悬液, 细胞分离液分离、 收集单个核细胞, 配成1×107/0.5 mL的细胞悬液, -80℃及37℃反复冻融3次, 15000 r/min离心30 min, 收集上清液即为肿瘤冻融抗原。

　　1.2.2  腋窝引流淋巴结单个核细胞的分离及TDLNC的诱导培养  手术摘取腋窝淋巴结（经涂片镜检未见癌细胞转移）1～2枚, 机械法制备单个核细胞悬液。该悬液37℃静置培养2 h, 吸出上层悬浮细胞, 调整细胞浓度为1×109/L, 加入rhIL2(20万 U/L), CO2培养箱中培养为肿瘤引流淋巴结细胞（tumor draining lymph node cells, TDLNC）。第7天以流式细胞术分析细胞表型。

　　1.2.3  DC的诱导培养及鉴定  取静置培养2 h的腋窝淋巴结单个核细胞, 刮刀刮取贴壁细胞, 调整细胞数为1×109/L, 加入rhGMCSF(100万 U/L)、 rhIL4(20万 U/L), CO2培养箱中培养, 于第5天按DC与肿瘤细胞1∶5比例加入肿瘤冻融抗原[2]和TNFα(20万 U/L), 诱导DC成熟; 不加肿瘤冻融抗原的作为未负载肿瘤抗原的DC。分别于第1天和第7天取2×106个细胞, 加入PECD1a、 PECD83、 FITCCD86 mAb, 流式细胞术分析细胞表型。

　　1.2.4  效应细胞的制备  自体肿瘤特异性CTL: 将负载自体肿瘤冻融抗原的DC与培养至第7天的TDLNC按1∶20比例混合, 并加入rhGMCSF、 rhIL4、 TNFα及rhIL2等细胞因子共同孵育3 d, 收集所得细胞即为肿瘤抗原特异性CTL（DCAgTDLNC）[3]。DC活化的TDLNC: 将未负载自体冻融抗原的DC按上述方法共同孵育3 d, 第10天收集所得细胞即为DC诱导的TDLN效应细胞（DCTDLNC）。

　　1.2.5  TDLNC的细胞表型分析  取方法1.2.2中诱导培养至第7天的TDLNC和方法1.2.4中培养至第10天的DCAgTDLNC、 DCTDLNC, 分别加入FITCCD3 mAb, FITCCD4/PECD8二联抗体, 检测其细胞表型。

　　2  结果

　　2.1  引流淋巴结诱导DC的形态学观察  倒置显微镜下观察, 乳腺癌患者淋巴结分离的单个核贴壁细胞于体外诱导培养第1天时, 呈表面光滑、 均匀一致的球形细胞, 散在分布, 个体较大, 表面有凸起, 贴敷于培养板底生长; 培养24 h 后, 开始有细胞悬浮; 3～4 d悬浮细胞较多, 聚集成团, 形成集落（图1A）; 培养 6～7 d时细胞体积明显增大, 约为开始时的1～1.5倍, 形态不规则, 多见长条形, 胞体表面出现刺状短突; 细胞大多数呈集束样悬浮或散在生长, 呈多边形; 第10 天时可观察到突起进一步增多增长, 具有成熟DC的形态特点（图1B）。

　　图1  来源于乳腺癌腋窝引流淋巴结的DC形态　略

　　2.2  DC表型分析  乳腺癌患者引流淋巴结单个核贴壁细胞, 第1天DC特异性标记CD1a、 CD83、 CD86的百分比（%）分别为11.0±2.4、 26.6±5.2和33.0±6.1。加入rhGMCSF和rhIL4培养7 d, 并经自体肿瘤冻融抗原加TNFα诱导后, CD1a、 CD83、 CD86的百分比（%）均升高, 与第1天的DC相比较, 均有统计学差异(P<0.01, 图2～4）。只用TNFα诱导DC的CD1a、 CD83、 CD86百分比（%）亦有升高, 有统计学差异(P<0.05)。两种不同诱导方法相比较, 经肿瘤冻融抗原加TNFα诱导后 CD83、 CD86的百分含量升高更明显（P<0.05, 图5）。

　　图2 －图5  略

　　2.3  诱导前后TDLNC表型分析  引流淋巴结细胞经体外诱导培养前, CD3+、 CD4+、 CD8+细胞百分比(%)分别为73.9±2.1、 27.3±2.6 和32.8±3.2。经DC诱导TDLNC后, DCAgTDLNC 组与DCTDLNC 组中CD3+ 和CD8+ T细胞的百分比(%)含量均升高(P<0.01), 其中CD8+ T细胞含量升高更显著; 而CD4+ T细胞含量变化无统计学意义（P>0.05）。两种DC诱导的结果相比较, CD3+、 CD8+ T细胞含量无统计学意义（P＞0.05, 表1）。

　　表1  诱导前后TDLNC细胞表型分析　略

　　3  讨论
   
　　本结果显示, 乳腺癌患者腋下淋巴结单个核细胞有一定水平CD1a、 CD83、 CD86的表达, 说明腋下淋巴结中含有成熟的DC。DC是功能最强的抗原提呈细胞（APC）, 非成熟的DC捕获抗原后被激活为成熟DC, 并将抗原肽递呈给CD4+和CD8+ T细胞, 诱导其成为抗原特异性CTL, 发挥抗肿瘤作用[4]。荷瘤患者体内, DC的功能存在缺陷或数量不足, 并在肿瘤组织微环境存在一些免疫抑制因子, 单独或协同抑制DC的抗原呈递等功能, 导致机体抗肿瘤免疫应答受抑, 促使肿瘤形成和[5, 6]。目前, 多采用体外模拟DC的成熟过程, 使其接触肿瘤抗原而致敏, 再将这些功能正常且负载了肿瘤抗原的DC回输体内, 可相对特异地诱导机体肿瘤特异性免疫应答, 起到作用[7]。采用肿瘤细胞冻融抗原刺激诱导DC, 使其负载特异性肿瘤抗原, 此方法不仅简便易行, 且无需分离鉴定肿瘤的特异性抗原, 可由DC去完成对抗原的识别、   摄取、 加工及提呈, 在主动性免疫治疗方面具有较大的应用价值。本结果显示, 用 rhGMCSF和rhIL4等细胞因子刺激、 活化, 自体肿瘤冻融抗原加TNFα致敏DC后, 其表面CD1a、 CD83、 CD86等分子表达较未诱导前均有明显上调。表明经自体乳腺癌细胞裂解物致敏的DC表面共刺激分子增多, 成熟度提高, 抗原提呈功能增强。DCAgTDLNC和DCTDLNC两组细胞中CD3+ 、 CD8+ T细胞含量均明显升高, 与诱导培养前相比有统计学差异, 但两组间无统计学差异。可能在DCTDLNC组中已存在一定量的成熟DC, 经TNFα诱导后, 表面亦携带有一定的刺激分子, 具有抗原提呈能力。综上所述, 乳腺癌患者腋下引流淋巴结单个核细胞在 rhGMCSF和rhIL4的刺激下, 可以分化为典型的成熟型DC。DC在自体肿瘤抗原和TNFα的诱导下成熟, 并具有较强的抗原提呈功能, 成熟的DC可以促进TDLNC增殖分化为肿瘤抗原特异性CTL。从乳腺癌患者腋下引流淋巴结单个核细胞中诱导具有正常功能的DC是一种可行的方法, 为进一步研究利用DC肿瘤疫苗治疗乳腺癌奠定了基础。

　　:

　　[1] Satthaporn S, Robins A, Vassanasiri W, et al. Dendritic cells are dysfunctional in patients with operable cancer[J]. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53(6): 510-518.

　　[2] 贾  鑫, 李  荣, 徐迎新, 等. 肿瘤细胞裂解物致敏树突状细胞对小鼠乳腺癌作用的研究[J]. 康复理论与实践, 2004, 10(2): 79-81.

　　[3] 庄奕宏, 李春妹. 外周血单核细胞来源树突状细胞体外扩增及诱导抗乳腺癌免疫的研究[J]. 国际检验医学杂志, 2006, 27(1): 3-6.

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　　[5] 段学燕, 龙金华, 肖  静, 等. 肿瘤微环境对树突细胞功能状态的影响[J]. 贵阳医学院学报, 2004, 29(5): 385-388.

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　　[7] Jefford M, Maraskovsky E, Cebon J, et al. The use of dendritic cells in cancertherapy[J].   Lancet, 2001, 2(6): 343-353.