鼠β

                      作者：魏晓丽, 施桥发, 李虹, 李婉宜, 蒋忠华, 李明远

【关键词】  mBD2;,真核表达;,免疫荧光;,RT

　　Cloning and eukaryotic expression of murine betadefensin2(mBD2)
 
　　[Abstract]  AIM: To clone murine beta defensin2 gene (mBD2) and to express the mBD2 protein eukaryotically. METHODS: Total RNA was isolated from the lungs of BALB/c mice which were injected with LPS in advance. The DNA fragment encoding mBD2 was amplified by RTPCR and inserted into the plasmid pcDNA31(+), which was then digested with EcoRⅠand Xho I to construct the recombinant plasmid, pcDNA31(+)/mBD2. The pcDNA31(+)/mBD2 was  identified by endonuclease digestion, PCR, and sequencing analysis. The SiHa cells were transfected with  pcDNA31(+)/mBD2 plasmid and  screened  by G418 of 100 mg/L over 20 days.  Steady expression of mBD2  was confirmed by immunofluorescent staining  and RTPCR. RESULTS: About 250 bp DNA fragment was amplified by RTPCR from lung total RNA of the mice injected with LPS. The eukaryotic expression vector, pcDNA3.1(+)/mBD2, was successfully constructed after inserting the mBD2 fragment into pcDNA31(+). Most of SiHa cells transfected with pcDNA31(+)/mBD2 and screened  by G418 could express the mBD2 protein, confirmed by immunofluorescent staining and RTPCR. CONCLUSION: The eukaryotic vector of pcDNA31(+)/mBD2 was successfully constructed and transfected into SiHa cells, which  established a solid foundation for further study on the biological characteristics and antitumor mechanisms of the mBD2 protein.

　　[Keywords]murine betadefensin2; eukaryotic expression; immunofluorescence; RTPCR

　　[摘 要]  目的: 对小鼠β防御素2（mBD2）基因进行克隆, 构建其真核表达载体, 筛选出稳定表达细胞株, 并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法: 通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素(LPS), 建立小鼠急性时相反应, 取其肺组织提取总RNA, 采用RTPCR方法扩增小鼠mBD2基因, 经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（+）真核表达载体, 对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2转染SiHa细胞, 采用G418进行稳定表达株的筛选, 用免疫荧光染色和RTPCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果: 提取小鼠肺组织总RNA, 采用RTPCR方法扩增了250 bp左右的产物, 通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切, 构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2。SiHa被该质粒转染后, 在100 mg/L G418浓度下筛选20 d, 得到了稳定表达mBD2的细胞株, 用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达, RTPCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论: 成功地构建了pcDNA3.1(+)/mBD2真核表达质粒, mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达, 这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。

　　[关键词]mBD2; 真核表达; 免疫荧光; RTPCR
   
　　抗菌肽是天然免疫的重要介质, 具有广泛的抗菌和抗病毒活性, 是机体防御感染的重要因素。防御素是最早发现的抗菌肽之一, 分为4个类型: α防御素、 β防御素、 植物防御素和昆虫防御素[1]。其中, β防御素在组织中的表达具有特异性, 在局部黏膜免疫中起重要作用。鼠β防御素（murine beta defensin, mBD）2和3可以趋化未成熟的树突状细胞（DC）及CCR6转染的HEK293细胞[2]。采用DNA疫苗的研究方法也证明了mBD参与了获得性免疫应答。已有的研究还发现, mBD对大多数带负电荷的真菌、 支原体、 螺旋体等致病微生物均有攻击作用。高等动物的细胞由于存在高度发达的细胞骨架系统,    且细胞膜中负电荷较低而免受攻击。癌细胞由于生长旺盛故细胞骨架系统不发达, 这可能是防御素对癌细胞具有抑制作用的原因之一[3]。我们通过构建mBD2真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2, 将其转染HPV16（+）宫颈癌细胞株SiHa细胞, 并对转染细胞进行稳定筛选及分析鉴定蛋白的表达, 为研究mBD2蛋白在抗宫颈癌中的作用机制研究奠定细胞学基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  选用4周龄BALB/c小鼠, 由四川大学华西医学实验动物中心提供。真核表达质粒pcDNA3.1(+)为本室保存, SiHa细胞株由四川大学华西医学中心免疫学教研室魏大鹏老师惠赠, 用RPMI1640细胞培养基（GIBCO公司产品）、 50 mL/L CO2条件下进行培养。LPS为Sigma公司产品, TRIZOL由Invitroge公司生产, 两步法RTPCR试剂盒为Fermentas公司产品, Premix Taq购自Takara公司, 胶回收试剂盒购自Omega 公司的E.Z.N.A GEL cycle Kit, 质粒提取使用Omega公司的E.Z.N.A Plasmid Mininprep KitⅠ。T4 DNA连接酶和限制性内切酶EcoRⅠ、 XhoⅠ均为Fermentas公司产品。引物合成由上海Invitroge公司完成。羊抗鼠mBD2抗体购自Santa cruz 公司, 荧光标记的兔抗羊IgG抗体、 辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG抗体和封闭用兔血清均购自Fermentas公司, DAB显色试剂盒为中杉金桥公司产品, 真核转染试剂Lipofectamine购自Invitrogen公司。凝胶成像仪和Gelpro analyzer 4.0软件购自Media Cybernetics(USA).

　　1.2  方法

　　1.2.1  mBD2总RNA的提取及cDNA合成  以50 mg/g的剂量给BALB/c小鼠腹腔注射LPS, 12 h后颈脱臼处死小鼠, 无菌条件下分离小鼠肺组织, 提取肺组织总RNA[4]。取1 mL总RNA进行反转录,    反应条件为60℃ 5 min, 42℃ 60 min, 85℃ 2 min。RT过程中采用oligo(dT)引物进行反转录获得cDNA, 以备PCR产物的合成。

　　1.2.2  PCR反应  根据GenBank中查得的mBD2基因序列(基因登陆号AJ011800)设计扩增mBD2基因的引物, 上游引物为(下划线为酶切位点): ACGAATTCGAGTGCCCTTTCTACCAG（EcoRⅠ）, 下游引物为: CTCTCGAGACTTCCATGTGCTTCCTT（XhoⅠ）扩增产物长度为257 bp, 其中34~244 bp处为mBD2全基因序列。PCR反应条件为: 94℃预变性4 min, 94℃变性30 s, 54℃退火35 s, 72℃延伸30 s, 30个循环后72℃ 10 min终止反应。同时设立小鼠βactin基因作为扩增反应阳性对照, 其上游引物为: CCATGGATGACGATATCGCTGC, 下游引物为: GCTTCTCTTTGATGTCACGCACG, 扩增片段长度为669 bp。

　　1.2.3  mBD2真核表达质粒的构建与鉴定  对PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒DNA分别采用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收目的片段, 经T4 DNA连接酶在16℃将mBD2基因插入pcDNA3.1(+)质粒。连接产物转化JM109感受态细胞, 挑取Amp筛选的阳性克隆并采用PCR及EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定, 最后将PCR及双酶切鉴定正确的质粒送上海Invitroge公司测序, 并分析克隆基因序列组成及其阅读框架的正确性[5]。取构建正确的pcDNA3.1(+)/mBD2质粒转染SiHa细胞株。

　　1.2.4  细胞培养及mBD2稳定表达株的筛选  SiHa细胞株于37℃、 50 mL/L CO2条件下在含有150 mL/L小牛血清、 100 mg/L青霉素及1×104U/L链霉素的RPMI1640培养基中进行培养。将生长良好的细胞用上述完全培养基调至2×108~5×108/L后按2 mL/孔分装至6孔板中, 待细胞贴壁生长至大约70%覆盖密度时进行转染。转染采用Lipofectamine试剂, 按pcDNA3.1(+)/mBD2 DNA 4 μg/孔、 转染试剂10 μL/孔对细胞进行转染, 同时设立空白质粒对照及不进行转染的对照孔。转染48 h后采用100 mg/L浓度进行G418稳定筛选[6], 在G418筛选20 d后挑选单克隆进行扩增, 用间接免疫荧光染色法对细胞内目的蛋白表达情况进行鉴定, 并在稳定筛选后4、 6、 8、 10周提取细胞总RNA, 采用RTPCR测定mBD2 mRNA的表达。

　　1.2.5  间接免疫荧光染色  将稳定筛选出的细胞于6孔板中进行细胞爬片培养, 24 h后用PBS洗6孔板3次, 每次2 min。加入4 mL/L多聚甲醛2 mL/孔, 室温固定30 min。洗板, 加入5 mL/L的Triton100 2 mL/孔, 室温放置30 min。洗板, 加入正常封闭兔血清20 mL/孔, 室温封闭30 min。加入1∶500稀释的羊抗鼠mBD2抗体, 4℃过夜。洗板, 加入1∶50稀释的荧光素标记的兔抗羊IgG抗体, 室温放置30 min。洗板, 风干后用500 mL/L的甘油封片。倒置荧光显微镜观察并记录细胞内mBD2蛋白表达情况并荧光照相记录实验结果。

　　1.2.6  mBD2蛋白稳定表达的RTPCR鉴定  采用RTPCR方法考察稳定转染的SiHa细胞中mBD2的mRNA表达情况, 方法同前。

　　2  结果

　　2.1  mBD2真核质粒的构建及鉴定  BALB/c小鼠经腹腔注射LPS后12 h, 分离小鼠肺组织, 提取到符合要求的肺组织总RNA。以该总RNA作为模板, 经过RTPCR扩增得到了大约250 bp左右的基因片段（图1）, 而βactin同样扩出了大约670 bp左右的条带。将该片段用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样经双酶切的质粒pcDNA3.1（+）载体连接, 连接产物经转化大肠杆菌JM109, Amp筛选出阳性克隆。重组质粒DNA经双酶切鉴定, 20 g/L琼脂糖凝胶电泳显示获得250 bp的插入片段（图2）。测序结果表明所构建的真核表达质粒不仅含有完整的mBD2基因全序列, 而且阅读框架也正确无误, 与设计的基因序列完全一致, 无碱基突变。

　　图1  小鼠mBD2 PCR扩增产物　略

　　图2  重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2酶切鉴定　略

　　2.2  真核转染及稳定表达株的筛选  在6孔板中采用pcDNA3.1(+)/mBD2质粒对SiHa细胞进行转染之后, 48 h后在培养基中加入G418进行稳定筛选, 20 d后挑取单克隆转入细胞培养瓶中进行克隆扩增培养, 获得稳定表达株。

　　2.3  稳定表达株的间接免疫荧光染色鉴定  间接免疫荧光染色后观察显示, 转染pcDNA3.1(+)/mBD2细胞胞质内存在mBD2蛋白表达（图3A）, 而转染pcDNA3.1(+)及未转染质粒的SiHa细胞在间接免疫荧光实验中均未观察到细胞内绿色荧光存在（图3B、 C）。

　　图3  mBD2蛋白在pcDNA3.1(+)/mBD2、 pcDNA3.1(+)转染SiHa细胞和对照细胞中的稳定表达　略

　　2.4  稳定表达株的RTPCR鉴定  对稳定稳筛4、 6、 8、 10周细胞株进行总RNA提取, 电泳可见3条明显的RNA条带。RTPCR反应中, 四个时间点的mBD2特异性引物PCR扩增同样得到了250 bp左右大小的目的片段, 证实稳定筛选得到的SiHa细胞株中有mBD2基因表达的mRNA, 与前述试验中提取的mBD2基因完全一致, 目的基因稳定表达。

　　3  讨论

　　1986年, Lichtenstern等[7]在鼠恶性畸胎瘤中首先发现了防御素对肿瘤细胞的裂解作用,提出了防御素参与肿瘤免疫的理论。将mBD2和mBD3的基因与B细胞淋巴瘤的表位（淋巴瘤特异性可变区重链VH 和轻链VL 片段）基因融合作为DNA疫苗免疫小鼠, 不仅使小鼠对非免疫原B细胞淋巴瘤抗原产生有效的体液免疫应答, 而且还能提高B细胞淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫的能力, 而这种模型鼠的抗肿瘤保护作用依赖于肿瘤特异性细胞免疫的产生[2]。目前对防御素参与肿瘤免疫的机制还不是很清楚, 主要集中于在作为内源性TOLL样受体4（TOLLlike Receptor 4, TLR4）的配体, 与肿瘤抗原结合, 刺激DC的成熟, 从而增强机体的细胞免疫,发挥抗肿瘤作用[8-10]。本研究致力于研究女性高发肿瘤宫颈癌, 试图将mBD2转染HPV16（+）的SiHa细胞, 通过稳定筛选获得稳定表达mBD2的细胞株, 以便今后经一步探讨mBD2蛋白在宫颈癌中的保护作用。防御素基因的表达方式有两种: 组成式表达和诱导式表达。哺乳动物防御素和植物防御素的表达包括这两种方式, 而昆虫防御素的表达只能在微生物入侵或引起发炎、 感染的诱导剂存在下, 才能诱导表达。正常情况下mBD3主要表达于黏膜组织的上皮细胞中, 在其他组织中因检测方法不同而出现微弱表达或者不表达[11] 。mBD2产生主要为诱导表达[12]。建立急性时相反应时内毒素剂量的选取与实验动物的品系、 内毒素的来源和纯度有关, 我们采用BABL/c小鼠腹腔注射高纯度的内毒素（LPS）, 分别提取肝、 脾、 肺及肾组织总RAN, 采用RTPCR方法克隆mBD2的全基因序列。通过实验证实, mBD2的诱导表达部位主要在肺组织及肾组织, 而在脾脏和肝组织表达很少。此外, 也有报道采用内毒素诱导从皮肤组织提取RAN, 扩增mBD2的基因[8]。本研究中选用的真核表达质粒pcDNA3.1(+), 由于它具有含有T7启动子, 便重组质粒的测序, 同时带有his标签, 可以用于真核细胞表达蛋白的分离及纯化。质粒序列中含有neo基因, 可被整合到细胞基因组中, 从而使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长, 并且能够表达外源DNA的特性, 因此可用于细胞转染后的稳定筛选。实验中我们将mBD2插入真核表达载体pcDNA3.1(+), 构建pcDNA3.1(+)/mBD2真核表达质粒, 并将其转染HPV16（+）的宫颈癌细胞株SiHa细胞, 通过G418的稳定筛选, 获得了稳定表达细胞株, 通过免疫荧光染色证实该蛋白的表达主要存在于细胞质及细胞膜表面, 同时对稳定筛选后不同时间点细胞的RTPCR证实了该mRNA的持续表达。我们建立的mBD2稳定表达细胞株为今后进一步研究防御素的抗肿瘤的免疫机制奠定了细胞学基础。

　　文献: 

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