亚毒性剂量阿霉素提高抗人DR4、 DR5抗体诱导的神经胶质瘤细胞凋亡的研究

                 作者：庄国洪, 宋玉国, 毕胜利, 杜柏榕, 朱迅

【关键词】  TNF相关凋亡诱导配体;,死亡受体;,凋亡;,阿霉素

　　Enhancement of glioma cell apoptosis induced by antihuman DR5/DR4 monoclonal antibodies by subtoxic dose of doxorubicin in human

　［Abstract］  AIM: To study the cytotoxic effects of doxorubicin on apoptosis in glioma cell lines U343, U138, U373 induced by antihuman DR4/DR5 monoclonal antibodies (FMU1.4/FMU1.5) and the underlying mechanism. METHODS: Expression of DR4/DR5 was quantitated by flow cytometry. Cytotoxicity exerted by FMU1.4/FMU1.5 on three cell lines was measured by MTT colorimetry and the induced apoptosis was determined by agarose gel electrophoresis. The expression of cytochrome C, FLIP and Ca2+ concentration were also measured. RESULTS: Following the treatment of doxorubicin DR4 and DR5 were highly expressed on the cell surface; The apoptosis of U138 and U373 induced by FMU1.4 and FMU1.5 was stronger. expression of cytochrome C and Ca2+ concentration were enhanced, whereas the expression of FLIP was downregulated. CONCLUSION: Subtoxic doxorubicin applied with antibodies caused higher cell death rate of glioma cells, which may be relevant to DR4/DR5, the release of cytochrome C and FLIP and Ca2+ concentration.

　　[Keywords]TRAIL; death receptor; apoptosis; doxorubicin

　　［摘 要］  目的: 探讨亚毒性剂量的阿霉素影响抗DR4、 DR5单克隆抗体（mAb） FMU1.4和FMU1.5诱导3株神经胶质瘤细胞株U343 （TRAIL敏感株）、 U138（TRAIL部分敏感株）及U373（TRAIL耐受株）凋亡的作用及可能的机制。方法: 采用流式细胞术检测DR4、 DR5的表达及神经胶质瘤细胞中DNA倍增。用MTT比色法检测mAb FMU1.4和FMU1.5对3株神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用。用共聚焦显微镜观察3株细胞中Ca2+ 的浓度。以Western blot检测细胞内色素C、 FLIP[FLICEinhibitory protein, 为一组含有死亡效应结构域（DED）的胞浆蛋白]的表达。结果: 亚毒性剂量的阿霉素作用后, DR5、 DR4在3株细胞中的表达提高; 而mAb FMU1.4、 FMU1.5诱导U138和U373细胞凋亡的作用增强, 细胞内细胞色素C的表达提高, FLIP的表达降低, Ca2+ 浓度增加。结论: 亚毒性剂量的阿霉素与抗DR4、 DR5 mAb联合应用后, 可提高mAb诱导靶细胞凋亡的效应, 其作用机制与DR4、 DR5、 细胞色素C、 FLIP的表达及Ca2+ 的含量有关。

　　［关键词］TNF相关凋亡诱导配体; 死亡受体; 凋亡; 阿霉素

　　死亡受体4、 5 ( death receptor4、 5, DR4、 DR5 )是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNFrelated apoptosisinducing ligand, TRAIL）的特异性、 高亲和力受体, 与TRAIL结合后可有效地激活细胞内信号转导途径, 诱导细胞发生凋亡反应。DR4、 DR5在许多肿瘤细胞上呈高表达, 而在正常细胞上很少表达。现有的研究证实, 抗DR4、 DR5单克隆抗体（mAb）可通过与DR4、 DR5的特异性结合诱导表达DR4、   DR5的肿瘤细胞凋亡。以死亡受体为靶点的肿瘤生物, 是目前该领域研究的热点之一。我们曾报道了抗DR5 mAb可诱导胶质瘤细胞U343凋亡, 凋亡率达80%[1]。Kang等[2]研究证实, 亚毒性剂量的阿霉素可提高TRAIL诱导的人前列腺癌细胞株LNCaP凋亡。我们报道了亚毒性剂量的阿霉素对抗DR4、 DR5 mAb FMU1.4及FMU1.5诱导的3株神经胶质瘤细胞凋亡的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  mAb FMU1.4和FMU1.5由第四军医大学金伯泉教授提供。人神经胶质瘤细胞株U343、 U138、 U373由加拿大阿尔博塔大学郝春海博士提供。放线菌素D（actinomycin D）、 阿霉素（doxorubicin, doxo）及5氟尿嘧啶（5fluorouracil, 5Fu）均为Amresco公司产品。FITC羊抗鼠IgG购自Promega公司。流式细胞仪（EPICS XL型）, 为美国Coulter 公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  DR4、 DR5在胶质瘤细胞株上表达的检测  胰酶消化细胞并调整细胞的密度为1×1010/L, 离心洗涤3 min后, 弃去上清, 加入抗DR4、 DR5 mAb FMU1.4及FMU1.5在冰上反应30 min, 洗涤3次。然后加1∶100 FITC羊抗鼠IgG, 洗3次后, 用流式细胞术检测, 每个标本计数10000个细胞。每组样品均设非特异性对照组。

　　1.2.2  mAb FMU1.4及FMU1.5对胶质瘤细胞增殖的抑制作用  细胞处理同前, 按20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 mg/L加入mAb FMU1.4及FMU1.5培养4 h, 每孔再加入6.25 g/L doxo共培养24 h。加入20 μL MTT（7.5 g/L）继续培养4 h, 加100 μL异丙醇, 于波长570 nm测定吸光度（A）值, 并抑制率（%）。抑制率=（1－实验组的A值/对照组的A值）×100%。实验重复3次, 取其平均值。

　　1.2.3  胶质瘤细胞DNA倍增的FCM分析   U343、 U138、 U373细胞的处理同前。收集细胞, 并调整细胞的密度为2×107/L, 按参照[1]的方法进行分析。

　　1.2.4  统计学分析  实验数据均用x±s表示, 两组间的比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  DR4、 DR5在胶质瘤细胞株上表达的检测  以亚毒性剂量（6.25 g/L）的doxo分别处理3株细胞24 h后, 用FCM检测细胞上DR4/DR5的表达。结果显示, 亚毒性剂量的doxo可上调DR5、 DR4在胶质瘤细胞上的表达, 但DR5的表达明显高于DR4（表1）。

　　表1  胶质瘤细胞上DR5/DR4的表达（略）

　　Tab 1  Expression of DR5 and DR4 on glioma cells

　　2.2  抗DR4、 DR5 mAb和doxo 对细胞增殖的抑制作用   MTT比色法检测显示, 胶质瘤细胞株对抗DR4和DR5 mAb 诱导的凋亡的敏感性不同, mAb FMU1.5诱导 U343细胞凋亡的作用较强, 且呈剂量依赖性, mAb FMU1.4诱导U343细胞凋亡的作用较弱; mAb FMU1.5和FMU1.4诱导U138和U373细胞凋亡的作用均较弱。doxo对U343细胞有强的杀伤效应, 对U138、 U373细胞也有一定的杀伤作用。125 mg/L的doxo对U343、 U138、 U373 3株细胞的杀伤率（%）, 分别是（51±024）%、 （1382±086）%、 （1154±024）%。 以20 mg/L 的mAb FMU14和FMU15与625 mg/L doxo联合或单独作用24 h, 对U343细胞株的杀伤率分别为（58.0±1.82）%和（8743±081）%; 对U138细胞株的杀伤率分别为（2623±186）%和（4812±124）%; 对U373细胞株的杀伤率分别为（1319±023）%和（2065±164）%。以上说明, 低剂量的mAb与亚毒性剂量的doxo 联合应用, 可提高mAb对3 株细胞的杀伤率并与高剂量的mAb的杀伤率相同, 其中对U343细胞的杀伤作用更明显。mAb与doxo联合应用与单独应用doxo的杀伤率相比较差异显著（P<0.01, 图1）。U343和U373细胞对放线菌素 D和5氟尿嘧啶敏感, U343细胞的杀伤率（%）分别为（467±085）%和（498±013）%; 对U373细胞的杀伤率（%）分别为（286±056）%和（371±011）%。

　　图1  20 mg/L 的 mAb FMU1.5/FMU1.4与 62.5 mg/L doxo联合作用对 U343、 U138及U373细胞的杀伤作用（略）

　　Fig 1  Cytotoxic effects of mAbs FMU1.5/FMU1.4（20 mg/L）in combination with doxo（62.5 mg/L） on U343, U138 and U373 cell lines

　　2.3  凋亡细胞DNA倍增的FCM分析[3]  FCM分析的细胞凋亡的百分率, 与MTT比色法检测的结果相符（表2）, 即低剂量的mAb与亚毒性剂量的doxo联合应用, 可协同提高对胶质瘤细胞的杀伤作用（图2）。以20 mg/L的mAb FMU1.4/FMU1.5与62.5 g/L的doxo联合作用后, 收集细胞, 用FCM检测凋亡细胞的DNA倍体发现有典型的细胞凋亡峰（图3）。

　　表2   40 mg/L的mAb FMU1.4和FMU1.5与doxo联合作用后凋亡细胞DNA倍增的FCM分析（略）

　　Tab 2  FCM analysis of apoptotic cell DNA multiplication after action of 40 mg/L mAbs FMU1.4/FMU1.5 in combination with doxo

　　图2  mAb FMU1.5/FMU1.4与 62.5 mg/L doxo联合作用对U343、 U138及U373细胞的杀伤作用（略）

　　Fig 2  Cytotoxic effects of mAb in combination with doxo on U343, U138, U373 cells Concn. of mAbs FMU1.5/FMU1.4 are from 0.625 mg/L to 20 mg/L

　　图3  分别与62.5 mg/L doxo 和20 mg/L FMU1.5/FMU1.4共培养24 h及4 h的3株胶质瘤细胞中DNA 断裂的百分率（略）

　　Fig 3  DNA fragmentation（%） in glioma cells cocultured with doxo（62.5 mg/L） and mAb FMU1.5/FMU1.4（20 mg/L） for 24 and 4 hours, respectively

　　2.4  抗DR4和DR5 mAb诱导胶质瘤细胞凋亡的形态变化  应用透射电镜观察发现, 以高剂量的mAb FMU1.5和125 mg/L doxo分别作用U343细胞4 h、 24 h后, 用透射显微镜观察。发现凋亡细胞呈不规则形, 出现核固缩、 核分裂, 染色质边缘化并浓缩或断裂成团块状; 细胞质内可见完整的细胞器, 线粒体呈空泡状, 高尔基体肥大（图4）。

　　图4  20 mg/L mAb FMU1.5与62.5 mg/L doxo共培养24 h的U343 细胞超微结构变化的透射电镜观察（略）

　　Fig 4  Oberservation of ultrastructural change of U343 cells cocultured with 20 mg/L mAb FMU1.5 plus 62.5 mg/L doxo for 24 h under transmission electron microscope (×7500)

　　A: U343+ FMU1.5+ doxo; B: Normal U343 cells. The arrows indicate to be site of nuclear membrane.

　　3  讨论

　　如何降低化疗药物的剂量, 减少对全身的毒副作用, 以及提高药物的疗效, 已成为临床的重要课题。化疗药物与抗死亡受体的抗体具有相似的细胞毒机制。抗死亡受体抗体的作用是诱导肿瘤细胞凋亡; 而化疗药物也是部分通过诱导凋亡来发挥细胞毒作用。[4, 5]已报道,化疗药物可通过上调肿瘤细胞表面DR4/ DR5的表达, 增强TRAIL对肿瘤细胞杀伤的敏感性。我们前期已报道[1], mAb FMU1.5不需要交联即可诱导U343神经胶质瘤细胞发生凋亡。mAb FMU1.4和FMU1.5能不同程度地诱导3株胶质瘤细胞凋亡（另报道）。U343细胞对mAb FMU1.5诱导的凋亡较敏感,  其次是U138细胞; 而U373细胞则对mAb FMU1.5的处理表现为耐受。U343细胞对mAb FMU1.4部分敏感, U138细胞对mAb FMU1.4不敏感; U373细胞对mAb FMU1.4耐受。3株神经胶质瘤细胞株上DR4/DR5的表达量从高到低, 依次是TRAIL敏感株U343、 部分敏感株U138和耐受株U373。实验表明, DR4的表达较DR5明显低, 而其mAb FMU1.4诱导细胞凋亡的作用也较抗DR5 mAb FMU1.5低。实验结果显示, mAb诱导细胞凋亡的作用与细胞表面DR4、 DR5的表达水平有一定的关系。本研究证实, 胶质瘤细胞株U138和U373细胞对mAb FMU1.4、 FMU1.5有抵抗, U343细胞对mAb FMU1.4有抵抗, 3株胶质瘤细胞对doxo均敏感。亚毒性剂量的doxo和5Fu可使对mAb FMU1.5不敏感的U138细胞转变为敏感株, 从而提高mAb FMU1.4/FMU1.5 诱导U138、 U373细胞凋亡的效应。mAb FMU1.5可增强doxo、 5Fu对细胞的杀伤效应, 表现为亚适剂量的FMU1.5与亚毒性剂量的doxo和5Fu可协同诱导肿瘤细胞凋亡。这种协同杀伤效应是通过诱导细胞凋亡而实现的, 其机制可能是由于凋亡链中的正反馈而使凋亡级联放大, 亦可能是亚毒性剂量的doxo、5Fu可高效阻断凋亡抑制蛋白或诱骗受体的生成, 而使TRAIL诱导的凋亡呈现高效。在未经任何处理的情况下, U343细胞中细胞色素C的表达量较高, U138细胞其次, U373细胞最低, 提示不同胶质瘤细胞系中细胞色素C的表达水平可能与细胞对TRAIL及mAb FMU1.4/FMU1.5的敏感性有关。doxo作用后, 细胞色素C在3株细胞中的表达水平均增强, 表明doxo与mAb FMU1.4/FMU1.5的协同作用, 可能与提高细胞色素C的表达水平有关。Guo等[6]报道, 抗DR5 mAb可通过非Caspase途径诱导肿瘤细胞凋亡。耐受株U373有FLIP的表达, 敏感株U343和部分敏感株U138均没有FLIP的表达。doxo作用后, 在3株细胞中都没有检测到FLIP 的表达（资料未显示）。从另一方面证实, FLIP与胶质瘤细胞对药物诱导凋亡的敏感性有关。这与Mori等[7]报道的doxo与TRAIL可通过下调FLIP的表达而协同诱导胶质瘤细胞其凋亡的结果相吻合。

　　文献:

　　[1] 庄国洪, 孙红光, 杜柏榕, 等. 抗人DR5单克隆抗体诱导U343细胞凋亡研究[J]. 肿瘤生物治疗杂志, 2004, 11（2）: 96-99.

　　［2］ Kang J, Bu J, Hao Y, et al. Subtoxic concentration of doxorubin enhances TRAILinduced apoptosis in human prostate cancer cell line LNCaP[J]. Prostate Cancer Prostatic Dis, 2005, 8(3): 274-279.

　　［3］ 董兰凤, 梅和珊, 宋淑霞, 等. rhIL22与阿霉素长循环热敏脂质体靶向治疗肿瘤的协同作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21（3）: 296-300.

　　［4］ Shiraishi T, Yoshida T, Nakata S, et al. Tunicamycin enhances tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligandinduced apoptosis in human prostate cancer cells[J]. Cancer Res, 2005, 65(14): 6364-6370.

　　［5］ Horinaka M, Yoshida T, Shiraishi T,  et al. Luteolin induces apoptosis via death receptor 5 upregulation in human malignant tumor cells[J]. Ongene, 2005, 138(1): 71-77.

　　［6］ Guo Y, Chen C, Zheng Y, et al. A novel antihuman DR5 monoclonal antibody with tumoricidal activity induces caspasedependent and caspaseindependent cell death[J]. J Biol Chem, 2005, 280 (51): 41940-41952.

　　［7］ Mori T, Doi R, Toyoda E, et al. Regulation of the resistance to TRAILinduced apoptosis as a new strategy for pancreatic cancer[J]. Surgery, 2005, 138(1): 71-77.