丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用
作者：蒋春梅, 刁振宇, 崔国兴, 钱万红, 邓小昭, 许可, 丁伟良, 谈永飞, 张云
【关键词】 丙型肝炎病毒;,F蛋白;,基因克隆;,蛋白表达;,抗体制备
Expression and preliminary study of HCV F protein gene
[Abstract] AIM: To express HCV F protein gene fragment in E.coli and detect if there is its antibody in HCV patients. METHODS: RNA of the virus identified as genetype 1b was choosed as template, the F protein gene was amplified by RTPCR. This gene fragment was inserted into plasmid vector pGEM simple T. F gene was digested by EcoR I and BamH I from pGEM and cloned into plasmid vector pGEX4T2.The ligation mixture was transformed into E.coli. TG1 and F fragment expression was induced by IPTG. The expressed protein was purified from lysates with Glutathione Sepharose 4B. The purified protein was used to identify whether there was antiF antibody in the patients which HCV RNA was positive by ELISA. RESULTS: After IPTG induction, a positive band about 43 kD was detected. 82 of 120 HCV RNA positive’s sera had antiF antibody by ELISA. CONCLUSION: It is possible to efficiently express the HCV F protein in E.coli. The positive rate of antiF antibody in HCV RNA positive patients was 68%.
[Keywords]hepatitis C virus; F protein; gene cloning; protein expression; antibody preparation
[摘 要] 目的: 构建丙型肝炎病毒(HCV)F基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌TG1中进行表达, 用以检测丙肝患者体内抗体, 并制备抗血清。方法: 提取患者血清中的HCV RNA, 并进行基因分型。取鉴定为HCV 1b型的病毒, 用RTPCR扩增HCV F蛋白基因的序列。将扩增产物插入pGEMT载体中, 测序正确后, 用EcoR I、 BamH I双酶切后, 再插入表达载体 pGEX4T2中, 转化大肠杆菌TG1, 在IPTG诱导下表达GSTF蛋白。用亲和层析法纯化GSTF蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GSTF蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果: 在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白, 经Glutathione Sepharose 4B 亲和层析柱纯化获得较高纯度的GSTF 融合蛋白。应用Western blot方法检测证实, 用纯化的GSTF蛋白免疫BALB/c小鼠得到了特异性的抗体。用纯化的GSTF蛋白进行ELISA检测120例丙肝患者血清抗F蛋白抗体, 82例呈阳性。结论: 通过上述方法制备的融合蛋白纯度较高, 免疫小鼠获得的抗体具有良好的特异性。用纯化的目的蛋白检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体的阳性率为68%, 与国外的报道接近, 说明在HCV感染的病程中有F蛋白的产生, 为研究HCV F蛋白及与HCV相关疾病的诊断和提供了条件。
[关键词]丙型肝炎病毒; F蛋白; 基因克隆; 蛋白表达; 抗体制备
丙型肝炎病毒（HCV）基因可编码十几种蛋白, 其中核心蛋白的功能最为复杂, 是病毒与宿主免疫相互作用的重要环节。近年发现, 核心蛋白的编码序列翻译时, 由于HCV核心基因第10~12位密码子富含腺嘌呤核苷酸（A）, 可能导致核糖体滑动, 发生2/+1框架漂移, 产生一种新型蛋白, 命名为F蛋白[1]。F蛋白是自然感染HCV过程中产生的, 其在不同基因型HCV中的高度保守性和可刺激患者产生相应抗体, 显示F蛋白在HCV感染与免疫中起重要作用。本研究中, 将F蛋白基因克隆于原核表达载体中, 通过IPTG诱导, 在大肠杆菌TG1中获得高效表达, 通过亲和层析法纯化GSTF蛋白, 制备抗血清; 并用纯化的蛋白检测丙肝患者体内的抗F蛋白抗体, 为以后更深入的研究F蛋白的生物学功能奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 120份HCV RNA阳性血清, 江苏省宜兴人民收集。E.coli TG1和pGEX4T2由本室保存。RT试剂盒为Promega公司产品。PCR试剂盒购自申能博彩公司。引物由上海博亚公司合成。各种限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 pGEM SIMPLE T载体及蛋白marker购自TaKaRa公司。DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司。HRP标记的羊抗人IgG、 羊抗鼠IgG购自南京阿恩地公司。6~8周龄BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司, 由南京军区军事医学研究所饲养。
1.2 方法:
1.2.1 HCV基因分型 采用Simmonds等[2]设计的5′NCR型特异性引物, 对分离自10个丙肝患者的HCV RNA进行分型。取5 μL HCV RNA溶液, 采用六聚体随机引物, 于20 μL体系中逆转录为cDNA。取5 μL cDNA, 采用下列型特异性引物, 内正义引物: 5′AGTGTCRTRCAGCCTCCAGG3′(99~118nt); 内反义引物1: 5′GGGGCACGCCCAAATCTCCA3′ (220~239nt）141 bp; 内反义引物2: 5′CAAATGACCGGRCATAGAGT3′（210~229nt）131 bp; 内反义引物3: 5′GCACGCCCAAATTTCTGGGT3′（217~236nt）138 bp; 内反义引物1b: 5′ACTACTCGGCTAGCAGTCTC3′（243~262nt）164 bp; 于50 μL PCR体系中进行PCR, 步骤为: 95℃ 5 min, 95℃ 1 min, 40℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共35个循环。
1.2.2 pGEMF载体的构建 以基因型为1b型的患者血清的HCV cDNA为模板, 采用下列4条引物, 扩增F蛋白基因的序列。正义引物的序列p1: 5′GTGGATCCCCAAACGTAACACC3′; 正义引物的序列 p2: 5′CTAAGCCTCAGAGAAAGCCAAACGTAACACC3′; 正义引物的序列p3: 5′GTGGATCCAGCACAAATCCTAAGCCTCAGAG3′; 反义引物的序列p4: 5′GAGAATTCGCAACCAGGCAGA 3′（斜体分别为BamH I、 EcoR I的酶切位点）。第1轮用p3、 p4作为引物扩增HCV cDNA, 第2轮用p2、 p4引物扩增第1轮的PCR产物, 第3轮用p1、 p4引物扩增第2轮的PCR产物。取第3轮的PCR产物0.5 μL、 pGEM SIMPLE T载体0.2 μL及Ligation Buffer 3 μL混合后, 于16℃连接过夜, 转化用氯化钙法制备的感受态大肠杆菌TG1。在铺有IPTG 及XGal 的氨苄青霉素平板上, 进行蓝白菌落筛选。挑取白色菌落, 用碱裂解法提取质粒DNA, 经酶切鉴定及测序证明正确, 说明HCV F蛋白基因已被克隆进T载体中, 命名为pGEMF载体。
1.2.3 重组表达载体pGEXF的构建 pGEMF载体用EcoR I及BamH I双酶切后, 进行琼脂糖凝胶电泳, 回收目的片断, 同时以同样的方法双酶切pGEX4T2载体并回收目的片断。用 T4 DNA连接酶于16℃连接过夜, 并转化用氯化钙法制备的感受态大肠杆菌TG1。在氨苄青霉素平板上于37℃培养过夜。次日随机挑取生长的菌落, 以碱裂解法抽提质粒DNA, 进行双酶切及测序鉴定, 构建pGEXF载体。
1.2.4 融合蛋白的诱导表达及纯化 将以pGEXF转化的大肠杆菌接种到LB 培养基中(含有100 mg/L的氨苄青霉素), 于37℃摇床振荡培养至A600=0.6～0.8左右。加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG, 于 37℃诱导培养4 h。收取菌液, 于4℃以4000 g离心10 min, 弃去上清, 进行SDSPAGE。每1 g大肠杆菌沉淀加入5 mL冰浴的裂解缓冲液中(含有1 mL/L的Triton X100, 1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF的磷酸盐缓冲液, pH74), 用超声波细胞粉碎机破碎菌体, 直至细胞悬浮液变得澄清(冰浴条件下进行)。将裂解液于4℃以12000 g离心15 min, 收集上清液, 与Glutathione Sepharose 4B混匀, 于室温搅拌混匀。将混合液体缓缓加入亲和层析柱上, 用10倍体积的PBS (pH74) 洗涤柱子3次, 再用洗脱液(10 mmol/L还原型谷胱甘肽及50 mmol/L的TrisHCl, pH80)洗脱。室温下静置10 min后, 收集洗脱下来的蛋白溶液, 进行SDSPAGE 鉴定, 并用Lowry法[3]测定蛋白浓度, 于-30℃保存备用。
1.2.5 抗F抗体的制备 取8只BALB/c小鼠, 1只作为空白对照, 7只用纯化后的融合蛋白皮下注射多点免疫。初次用40 μg/只免疫, 两周后用剂量20 μg/只加强免疫1次。1周后取鼠尾血用间接ELISA 法检测抗体效价超过1∶10000。接着以剂量20 μg/只加强免疫1次, 1周后摘眼球取血。
1.2.6 抗F蛋白抗体的Western blot检测 将融合蛋白经SDSPAGE分离后再电转移至PVDF 膜上。以5 g/L脱脂奶粉封闭1 h, 依次滴加(1∶100)鼠抗GSTF抗血清(室温反应2 h, TBS洗涤4次)及(1∶1000)羊抗鼠IgG(室温反应2 h, TBS洗涤4次), 然后用DAB溶液显色, 双蒸水冲洗终止反应。
1.2.7 血清中抗F抗体的检测 采用间接ELISA法检测血清中抗体的效价。以1 mg/L纯化的GSTF蛋白于4℃包被酶标板过夜。用PBST洗3遍后, 每孔加入含10 g/L BSA的PBST 100 μL, 于37℃封闭2 h。PBST洗3遍后, 加入用PBST稀释的丙肝患者血清(1∶10), 于39℃反应0.5 h。PBST 洗3遍后, 加入HRP标记的羊抗人IgG(1∶3000 稀释), 于37℃反应1 h; PBST洗3遍。加入含过氧化氢的底物邻苯二胺溶液, 室温避光显色10 min, 以2 mol/L H2SO4终止反应, 用酶标仪检测A490值。
2 结果
2.1 HCV基因的分型 以数对内外正反义引物进行PCR扩增10例丙肝患者血清中逆转录的HCV RNA。PCR产物经琼脂糖电泳分析显示, 8份血清用在内正义引物及内反义引物1b、2、1型特异性引物扩增下分别出现大小为164、131、141 bp的条带, 2份血清在内正义引物及内反义引物1b、 1型特异性引物扩增下分别出现164、 141 bp的条带, 说明前者是1b型和2型的混和感染, 后者为1b型感染(图1)。
图1 不同基因型PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）
Fig 1 Analysis of PCR product of different genotypes by agarose gel electrophoresis
A: Mixed infection of types 1b and 2; B: Type 1b infection.
2.2 HCV基因的扩增及pGEMF载体的构建 以基因型为1b型的丙肝患者血清中的HCV cDNA为模板, 以p1~p4为引物进行PCR扩增, 得到531 bp的DNA片段（图2）, 片段的大小同预期的大小相符, 无杂带。将PCR产物连接入pGEM载体后, 转化大肠杆菌TG1, 经蓝白斑筛选。挑取白色菌落用碱裂解法提取质粒DNA, 经酶切鉴定（图2）及测序证明均正确。
图2 pGEMF重组质粒的酶切鉴定（略）
Fig 2 Restriction enxyme digestion analysis of recombinant plasmid pGEMF
1: DNA marker; 2: PGEMF/EcoR I+BamH I; 3: PCR product of F gene.
2.3 重组表达载体pGEXF的构建 双酶切pGEMF回收目的片段, 克隆入pGEX4T2载体中, 即得到pGEXF。以其转化大肠杆菌TG1, 提取质粒用EcoR I和BamH I进行酶切鉴定后, 测序结果和报道一致, 表明重组质粒pGEXF构建成功。
2.4 重组蛋白的表达与纯化 将带有重组质粒的菌株用IPTG诱导表达后, 进行SDSPAGE。结果表明, 重组质粒pGEXF表达产物的大小为43000的融合蛋白, 大小同预期结果相符。将菌液用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化后, 进行SDSPAGE仅出现单一条带(图3)。
2.5 抗F蛋白抗体的Western blot检测 将小鼠抗血清1∶100稀释后, 作为一抗进行Western blot鉴定, 相应位置有一明显的特异性杂交带, 说明产生的鼠抗GSTF血清是F蛋白的特异性抗体（图4）。
图3 纯化的融合蛋白的SDSPAGE分析（略）
Fig 3 Analysis of purified fusion protein by SDSPAGE
1: Purified F protein; 2: Protein marker; 3: PGEXF expressed after IPTG induction; 4: PGEX4T2 expressed after IPTG induction.
图4 抗F蛋白抗体的Western blot分析（略）
Fig 4 Western blot analysis of antiF protein antibody
1: Protein marker; 2: GSTF.
2.6 血清中抗F蛋白抗体的检测 以GST作为阴性对照, 用ELISA法检测表明, 120例患者血清中82例可检出抗F抗体。
3 讨论
F蛋白是一个新发现的HCV蛋白, 其ORF与编码核心蛋白的序列重叠。Xu等[1]研究发现, 产生F蛋白的核糖体读码框移位起始于Core基因第8～11位密码子富含A的序列, 移位连接点大约在第11位密码子, 由此产生的F蛋白和Core蛋白在N端具有相同的氨基酸序列, 差异发生在第10个氨基酸之后。F蛋白在第161位密码子（+1框TGA）终止。F蛋白的半衰期短, 定位于内质网[4]。F蛋白的长度显示其基因特异性。基因型1a编码162个残基的F蛋白[6, 8], 基因型1b编码144残基F蛋白[5, 7, 10], 基因型2a编码126残基F蛋白[9], F蛋白的长度显示出其基因型的特异性。不同基因型的F蛋白呈序列保守性, 密码于814序列富集腺嘌呤, 并且在已报道的HCV序列中高度保守。不同的HCV基因型, 其F蛋白均较为保守。例如, 含有162个密码子的F蛋白开放阅读框, 在HCV1a序列中高度保守(100%), 长度从126密码子到155密码子的F蛋白在其大多数HCV序列中也是保守的, 在所有感染HCV的克隆中, 均包含完整的F蛋白ORF[5-10]。F蛋白在HCV感染期间表达, 可诱导机体产生特异性的细胞和体液免疫应答, 但其诱导的免疫应答是否具有保护性尚不清楚[11], 需要进一步研究核心蛋白与F蛋白之间究竟是什么关系; F蛋白在病毒复制、 成熟中究竟起什么作用; F蛋白在HCV感染过程中扮演什么角色？F蛋白是否可调节宿主基因表达, 并诱导肝细胞癌和脂肪变性等功能？还有待进一步研究。本研究构建了F蛋白基因的原核表达系统。我们从丙肝患者血清中提取HCV RNA逆转录成cDNA。选取Simmonds分型为1b型的cDNA, 根据基因库中HCV RNA全长序列设计引物, 扩增出核心段0框N端10个氨基酸序列和+1框10As~C端的序列, 做融合表达。由于核心序列发生了+1位移位, 导致在中途提前出现终止密码子TGA, F蛋白编码结束。实验结果显示, 重组质粒表达出一个大小为43000的融合蛋白, 大小和预期的结果符合。将大肠杆菌高效表达的融合蛋白用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化后, 免疫BALB/c小鼠, 并通过Western blot鉴定其具有较高的亲和性和特异性。在抗HCV抗体阳性的血清标本中, 仅少数HCVAg呈阳性, 可能是因为当血清中出现抗HCV抗体时, HCVAg的水平已降低或被抗体包裹而难以检出[12]。所以, 我们用纯化后的GSTF蛋白作为抗原来检测丙肝患者血清抗F蛋白的抗体, 结果阳性率为68%, 与KomurianPradel等的报道相近[13], 为进一步研究F蛋白的功能奠定了基础。
文献:
[1] Xu Z, Choi J, Yen TS, et al. Synthesis of a novel hepatitis C virus protein by ribosomal frameshift[J]. EMBO J, 2001, 20(14): 38403848.
[2] Simmonds P, McOmish F, Yap PL, et al. Sequence variability in the 5’ noncoding region of hepatitis C virus: identification of new virus type and restriction on sequence diversity[J]. J Gen Virol, 1993, 74(Pt4): 661-668.
[3] Bollag DM, Rozycki MD, Edelstein SJ. Protein Methods[M]. New York: Wiley Liss, 1996: 68-69.
[4] Xu Z, Choi J, Lu W, et al. Hepatitis C virus F protein is a shortlived protein associated with the endoplasmic reticulum[J]. J virol, 2003, 77(2): 1578-1583.
[5] Beard MR, Abell G, Honda M, et al. An infectious molecular clone of a Japanese genotype 1b hepatitis C virus[J]. Hepatology, 1999, 30(1): 316-324.
[6] Kolykhalov AA, Agapov EV, Blight KJ, et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA[J]. Science, 1997, 277(5325): 570-574.
[7] Lohmann V, Korner F, Koch JO, et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line[J]. Science, 1999, 285(5424): 110-113.
[8] Yanagi M, Purcell RH, Emerson SU, et al. Transcripts from a single fulllength cDNA clone of hepatitis C virus are infectious when directly transfected into the liver of a chimpanzee[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(16): 8738-8743.
[9] Yanagi M, Purcell RH, Emerson SU, et al. Hepatitis C virus :an infectious molecular clone of a second major genotype (2a) and lack of viability of intertypic 1a and 2a chimeras[J]. Virology, 1999, 262(1): 250-263.
[10] Yanagi M, St Claire M, Shapiro M, et al. Transcripts of a chimeric cDNA clone of hepatitis C virus genotype 1b are infectious in vivo[J]. Virology, 1998, 244(1): 161-172.
[11] Bain C, Parroche P, Lavergne JP, et al. Memory Tcellmediated imune responses specific to an alternative core protein in hepatitis C virus infection[J]. J Virol, 2004, 78(19): 10460-10469.
[12] 时红波, 谢 立, 黄德庄, 等. 血清丙型肝炎病毒抗原的免疫酶斑点法检测[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(3): 336-338.
[13] KomurianPradel F, Rajoharison A, Beriand JL, et al. Antigenic relevance of F protein in chronic hepatitis c virus infection[J]. Hepatology, 2004, 40(4): 900-909.
