不同刺激剂和培养环境对CD4+ 、 CD8+ T细胞内细胞因子表达的影响

【关键词】  流式细胞术;,T细胞亚群;,细胞因子;,刺激剂;,培养条件

　　Cytokine expression of CD4+ and CD8+ T cells induced by different stimuli under different culture conditions

　　[Abstract]  AIM: To investigate the effect of different stimuli and different culture conditions on the cytokine expression of CD4+ and CD8+ T cells. METHODS: PBMCs  were isolated from normal human peripheral blood and cultured with three kinds of stimuli (PHA, antiCD3 and antiCD28 mAbs, PMA and ionomycin) under four different culture conditions (room temperature, 37℃ water bath, 37℃ incubator, 37℃ and 50 mL/L CO2 incubator) for 4.5~5 h and intracellular cytokines (IL2, IFNγ and TNFα) in T cells were assessed by flow cytometry (FCM). RESULTS: Cytokine expression of CD4+ and CD8+ T cells varied when treated with different stimuli under different conditions. PMA had the strongest stimulative effect on cytokine expression of PBMC, while the effect of antiCD3 mAb was weaker, and that of PHA was the weakest. Different culture conditions did not greatly change the cytokine expression profile of T cells (P>0.05) except that there were very few cytokine producing cells when PBMCs were cultured at room temperature. CONCLUSION: AntiCD3 and antiCD28 mAbs, PMA and ionomycin are recommended for the stimulation of PBMCs and detection of intracellular cytokine using FCM. Culture temperature but not the concentration of CO2 is the most important factor during the short term T cell stimulation.

　　[Keywords]flow cytometry; T cell subset; cytokine; stimulus; culture condition

　　[摘 要]  目的: 探讨不同的刺激剂和不同的培养条件对CD4+和CD8+ T细胞内细胞因子表达的影响。方法: 分离正常人的外周血单个核细胞（PBMC）, 分别加入3种不同的刺激剂（PHA, 抗CD3和抗CD28 mAb, PMA和离子霉素）, 置于4种不同的培养环境下（室温, 37℃水浴, 37℃培养箱, 37℃ 50 mL/L CO2培养箱）培养45~5 h。收集细胞, 以荧光素mAb标记后, 用流式细胞术分析CD4+、 CD8+ T细胞内IL2、 IFNγ和TNFα的表达。结果: CD4+和CD8+ T细胞内细胞因子的表达, 随着刺激剂的不同而有所差别, 且在上述4种培养环境中, PMA的刺激效果最强, 抗CD3 mAb次之, PHA的刺激效应最弱。以上述3种刺激剂刺激后, 不同培养条件对T细胞内细胞因子的表达有一定的影响。室温培养时几乎检测不到细胞因子的表达, 而在37℃水浴、 37℃培养箱和37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养时, 表达细胞因子的CD4+和CD8+ T细胞的百分率差异无统计学意义（P>0.05）。结论: 不同刺激剂体外刺激T细胞表达细胞因子的效应不同,依次为PMA和离子霉素>抗CD3和抗CD28 mAb>PHA。体外刺激培养的T细胞活化过程中, 温度是重要的条件, CO2无明显影响。

　　[关键词]流式细胞术; T细胞亚群; 细胞因子; 刺激剂; 培养条件

　　应用荧光素标记的抗细胞表面抗原的单克隆抗体（mAb）和抗细胞因子的mAb, 流式细胞术不仅可检测单个细胞内的多种细胞因子, 还可区分表达特定细胞因子的细胞亚群[1]。但该技术涉及的环节较多, 因此, 需对各方面的影响因素进行探讨。我们曾分析了刺激时间和固定破膜剂等因素对该方法的影响[2], 但对于不同刺激剂和不同培养环境对细胞内细胞因子表达的影响尚未见报道。为此, 本研究中分析了3种刺激剂（PHA, 抗CD3和抗CD28 mAb, PMA和离子霉素）以及4种培养环境（室温, 37℃水浴, 37℃培养, 37℃ 50 mL/L CO2条件下培养）对CD4+和CD8+ T细胞内细胞因子表达的影响。本研究可为在没有CO2培养箱的条件下, 用流式细胞术检测细胞表面和细胞内的细胞因子提供实验依据, 同时为流式细胞术检测的标准化奠定了基础。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  PerCP标记的抗CD8 mAb（PerCPantiCD8 mAb）、 APC标记的抗CD4 mAb (APCantiCD4 mAb)、 PE标记的抗TNFα mAb (PEantiTNFα mAb)、 PE标记的抗IL2 mAb（PEantiIL2 mAb）、 FITC标记的抗IFNγ mAb (FITCantiIFNγ mAb)及匹配的同型对照mAb抗体, 均购自美国BD公司。佛波酯（PMA）、 离子霉素(Ionomycin)、 布雷杆氏菌素A（BFA）、 皂苷(Saponin)等, 均购自Sigma公司。鼠抗人CD3和抗CD28 mAb购自美国BDPharMingen公司。RPMI1640培养液和Hank’s液购自GIBCO公司。葡聚糖泛影葡胺（Ficollhypaque）购自上海华精生物科技公司。BD FACScalibur 流式细胞仪为美国BD公司产品。CO2培养箱为美国RS Biotech公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  PBMC的分离及刺激培养  抽取5例健康体检者（男3例, 女2例, 平均年龄28岁）的静脉血各10 mL, 肝素抗凝后, 加Hank’s液稀释, 用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心（于22℃以800 g离心20 min）。吸取上、 中层界面的白色云雾状层, 即为PBMC。充分洗涤后, 计数, 用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬PBMC, 并调整细胞的密度为2×109 /L。将细胞分为3份, 分别加入不同的刺激剂PHA（终浓度为5 mg/L）、 抗CD3和抗CD28 mAb（终浓度分别为0.2 mg/L和1  mg/L）、 PMA和离子霉素（终浓度分别为25 μg/L和1 mg/L）, 同时加入终浓度为10 mg/L的蛋白转运抑制剂BFA。充分混匀后, 再将每份细胞分为4份, 分别置于室温、 37℃水浴箱、 37℃培养箱及37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养4.5~5 h。

　　1.2.2  细胞表面和细胞内细胞因子的染色  收集培养的PBMC, 用PBS洗涤2次, 每管加入固定剂40 g/L多聚甲醛2 mL, 振荡混匀后, 放置室温中固定8 min。固定后, 每管加入3 mL PBS洗两次。去上清, 加入200 μL含有皂苷的缓冲液作用过夜。吸取100 μL细胞悬液, 分别加入10 μL不同荧光素标记的抗CD8、 抗CD4、 抗IFNγ、 抗TNFα或抗IL2 mAb, 轻轻振荡混匀, 于4℃避光反应30 min。孵育结束后, 加入3 mL PBS洗涤细胞, 去上清, 每管加入0.5 mL 10 g/L多聚甲醛固定液固定后待测。

　　1.2.3  流式细胞术分析  打开流式细胞仪的双激光光源, 首先设门于淋巴细胞（图1A）, 再以CD4+和CD8+ T细胞设门（图1B）。FL1和FL2荧光通道则以相应的同种型小鼠IgG染色的细胞作阴阳性的分界线, 仔细设置各荧光通道之间的荧光补偿, 然后检测CD4+ 和CD8+ T细胞中表达细胞因子的T细胞的百分率（图1C, 图1D）。收集细胞20000~30000个, 并用CellQuest软件分析结果, 数据用SPSS12.0统计软件进行处理。

　　图1  在PMA刺激下, 4种培养环境培养的T细胞中3种细胞因子的表达（略）

　　Fig 1  Expression of 3 cytokines in CD4+ and CD8+ T cells cultured under the conditions of 4 different cultures after PMA stimulation

　　FSC: Forward scatter; SSC: Side scatter. R1: Lymphocytes; R2: CD8+ T cells; R3: CD4+ T cells. The numbers in the density plot are the percentage of cytokineproducing cells among CD4+ (C) and CD8+ (D) T cells. A: Density plot of FSC vs SSC allows identification of lymphocytes; B: Density plot of CD8 vs CD4 allows identification of CD4+ and CD8+ T cells; C: Expression of 3 cytokines in CD4+ T cells; D: Expression of 3 cytokines in CD8+ T cells. RT: Room temperature; WB: Water bath.

　　2  结果

　　2.1  不同的刺激剂和培养环境对细胞因子表达的影响  在PMA + 离子霉素刺激下, 于室温中培养的CD4+ T细胞（图1C）和CD8+ T细胞（图1D）均不表达TNFα、 IL2和IFNγ; 而在37℃水浴、 37℃培养箱和37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养的条件下, CD4+ T和CD8+ T细胞均表达上述3种细胞因子。但表达这些细胞因子的CD4+和CD8+ T细胞的百分率不同。CD4+ T细胞高表达IL2、 低表达IFNγ; 而CD8+ T细胞高表达IFNγ、 低表达IL2。另外, 不同的刺激剂对CD4+和CD8+ T细胞表达细胞因子的影响不同。结果表明, 与PHA相比较, PMA+离子霉素刺激后, IL2、 IFNγ及TNFα的表达最高, 其次为抗CD3+抗CD28 mAb。另外, 不同温度条件下培养对细胞因子的表达也有影响。在室温条件下培养时, 3种刺激剂均不能刺激T细胞表达IL2、 IFNγ、 TNFα; 而在其他3种条件下培养时, 同一种刺激剂刺激所诱导的同一种细胞因子的表达无统计学意义（P>0.05）, 但室温与37℃培养的条件比较则有统计学差异（P<0.05或P<0.01）（图2）。
 
　　图2  不同的刺激剂和培养环境对CD4+和CD8+ T细胞内细胞因子表达的影响（略）  

　　Fig 2  The effects of different stimulators and culture conditions on cytokines expression in  CD4+ and CD8+ T cells

　　□atRT;  WB at 37℃; ■ Incubator at 37℃; Incubator containing 50 mL/L CO2 at 37℃. aP<0.05, bP<0.01 vs at RT under the same stimulation condition.

　　2.2  CD4+和CD8+ T细胞表达细胞因子的差异  当以PMA或抗CD3 mAb刺激PBMC时, 在37℃水浴、 37℃培养箱和37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养4.5~5 h后, CD4+和CD8+ T细胞均可表达细胞因子。进一步分析的结果表明, 当以抗CD3 mAb刺激PBMC时, CD8+ T细胞中IFNγ和TNFα的表达均显著高于CD4+ T细胞。当以PMA刺激PBMC时, 表达IL2的T细胞中, CD4+ T细胞的阳性率显著高于CD8+ T细胞（P<0.05）; 而在表达IFNγ的T细胞中, CD8+ T细胞的阳性率则显著高于CD4+ T细胞（P<0.05）。表达TNFα的T细胞中, CD4+ T细胞与CD8+ T细胞的阳性率无统计学差异（图3）。

　　2.3  抗CD3 mAb/PMA诱导细胞因子表达的特点  当以抗CD3 mAb刺激时, 大多数CD4+ T细胞只表达TNFα或同时表达TNFα和IFNγ; 而大多数CD8+ T细胞可同时表达TNFα和IFNγ或只表达IFNγ, 仅表达IL2的细胞只占少数。当以PMA刺激时, 获得类似的结果, 但表达细胞因子的细胞的百分率明显增加（图4）。

　　图3  CD4+和CD8+ T细胞表达细胞因子的差异（略）

　　Fig 3  Difference of cytokine expression in CD4+ and CD8+ T cells

　　□CD4+ T cells; ■ CD8+ T cells. aP<0.05, bP<0.01 vs the percentage of cytokineproducing CD4+ T cells.

　　图4  抗CD3 mAb/PMA诱导CD4+和CD8+ T细胞表达细胞因子的特点（略）

　　Fig 4  Characteristics of cytokines expression of CD4+ and CD8+ T cells induced with antiCD3 mAb or PMA

　　3  讨论

　　近年来, 利用流式细胞术在单个细胞水平上分析细胞表面标志和细胞内细胞因子的表达, 它具有特异性强、 敏感度高、 快速省时及易于操作等特点, 在临床和科研中已广泛应用[3-5]。由于活化的T细胞才能产生细胞因子, 为此, 我们采用了3种多克隆刺激剂PHA、 PMA和离子霉素、 抗CD3和抗CD28 mAb刺激PBMC后, 并置于4种不同的培养环境（室温, 37℃水浴, 37℃培养箱, 37℃ 50 mL/L CO2培养箱）中进行培养, 观察T细胞中细胞因子的表达情况。结果表明, PMA的刺激效果最强, 抗CD3 mAb次之, PHA的刺激效应最弱。几种不同的培养环境对CD4+ 和CD8+ T细胞表达细胞因子影响的结果显示, 室温培养时, 表达细胞因子的T细胞的比率很低, 但其他3种培养环境相比较, 差异无统计学意义（P>0.05）, 尤其用抗CD3 mAb刺激时, 结果非常稳定, 提示温度是重要的条件。CO2的主要作用是维持培养体系的酸碱度, 若细胞在体外只短期（4.5~5 h）培养, 培养箱中有无CO2对实验的结果影响不大。T细胞非均一的细胞群体, 根据功能和MHC分子限制性的不同, 可将成熟的T细胞分为CD4+和CD8+ T细胞两个亚群[6, 7], 它们表达的细胞因子有所差异[8, 9]。Jason等[8]报道, 在PHA/PMA/离子霉素刺激淋巴细胞4~5.5 h后, 表达IL2的CD4+ T细胞的百分率高于CD8+ T细胞; 而表达IFNγ的T细胞的比率则恰相反, 但表达TNFα的细胞的比率在两群T细胞间无明显差别, 与本实验的结果基本一致。但上述细胞因子的表达情况在以抗CD3 mAb刺激时则稍有差异, 即表达TNFα的CD8+ T细胞的比率高于CD4+ T细胞。关于上述3种细胞因子同时表达的情况, 本研究的结果也与Jason等的报道基本一致, 即以PMA刺激时, CD4+ 和CD8+ T细胞中同时表达IFNγ 和TNFα、 IFNγ 和IL2的细胞的比率均较高, 而以抗CD3 mAb刺激时, 同时表达IFNγ和IL2 的CD4+ 和CD8+ T细胞的比率很低, 与用特异性抗原刺激时所观察到的结果较为相似[10]。总之, 通过分析不同的刺激剂和不同的培养环境对细胞内细胞因子表达的影响, 可选择不同的刺激剂和不同的培养条件, 这不仅更有利于流式细胞术的普及, 而且为该技术在科研和临床中的应用并使其标准化奠定了基础。

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