桑色素对小鼠T淋巴细胞体外活化、 增殖和细胞周期的影响
作者：臧宁, 曾耀英, 黄秀艳, 王通, 叶雪仪, 周建国, 王会营
【关键词】 桑色素;,T细胞活化;,增殖;,细胞周期
The effect of morin on activation, proliferation and cellcycle of murine T lymphocytes in vitro
[Abstract] AIM: To discover the effects of morin on the activation, proliferation and cellcycle of murine T lymphocytes in vitro. METHODS: Murine lymph nodederived T lymphocytes were separated and stimulated with concanavalin A (ConA) and different experimental groups were set by cocultured with morin of different final concentration. Flow cytometry (FCM) was used to detect the activation, proliferation [carboxylfluorescein diacetate, succinimide ester (CFDASE) staining] and cellcycle [propidium iodide(PI) staining] of T cells. RESULTS: After 6 h time of culture in vitro, the rate of CD69+ T cells in control group was (2.97±0.12)%, while it was significant higher in ConA group[(72.52±0.66)% (P<0.01)]. Morin could downregulate this rate at final concentration being 25, 50 and 100 μmol/L, with a peak at 100 μmol/L morin[(48.95±0.81)% (P<0.01)]. CFDASE staining showed that at 48 h and 72 h, the proliferation indexes (PI) of T cells in ConA group were (1.58±0.04) and (1.95±0.02), respectively. Morin could significantly decrease the PI value at all experimental concentration, with the peak effect at 100 μmol/L morin, which the PI for 48 h was (1.02±0.02) and (1.03±0.01) for 72 h (P<0.01). FCM analysis of PI staining implied that the percentage of S phase cells in ConA group was (27.05±0.39)%, significantly higher than that in control group (5.10±0.07)%; and the 25 and 50 μmol/L morin groups showed higher S phase cell rates. CONCLUSION: Morin can significantly inhibit ConA stimulated activation and proliferation of murine T lymphocytes, in which the S phase lagging may serve as one of the major mechanisms.
[Keywords]morin; T cells activation; proliferation; cell cycle
[摘 要] 目的: 研究桑色素(morin)对小鼠T淋巴细胞活化、 增殖和细胞周期的影响。方法: 以刀豆蛋白A(ConA)刺激培养的淋巴结来源的小鼠淋巴细胞, 再以不同终浓度的morin与T细胞共培养, 利用流式细胞术(FCM), 检测早期T细胞活化的标志CD69分子的表达, 以羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰脂(CFDASE)染色检测T细胞的增殖; 以碘化丙锭(PI)染色分析T细胞的细胞周期。结果: 小鼠T细胞培养6 h后, 未经ConA刺激的对照组中CD69+T的细胞比率为(2.97±0.12)%, 经ConA刺激的CD69+T细胞的比率明显增高, 达到(72.52±0.66)%, 与对照组相比差别明显(P<0.01)。终浓度为25、 50、 100 μmol/L的morin均下调CD69+T细胞的比率, 其中, 100 μmol/L的morin抑制作用最强, 为(48.95±0.81)%, 与对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。CFDASE染色分析显示, ConA组培养48 h和72 h的T细胞的增殖指数（PI）分别为(1.58±0.04)和(1.95±0.02), 各浓度的morin对ConA刺激的T细胞增殖, 具有明显地抑制作用, 以100 μmol/L的morin抑制作用最明显。培养48 h的ConA组T细胞的PI为(1.02±0.02)、 培养72 h的ConA组T细胞的PI为(1.03±0.01), 与相应时间的对照组比较, 均有统计学意义(P<0.01)。PI染色后流式细胞术分析的结果表明, ConA组处于S期的T细胞的比率为(27.05±0.39)%, 显著高于对照组的比率(5.10±0.07)%。morin组中S期的细胞比率较高。 结论: Morin可显著抑制ConA刺激的T细胞活化及增殖; 其对增殖的抑制作用主要表现为S期的细胞的阻滞。
[关键词]桑色素; T细胞活化; 增殖; 细胞周期
桑色素(morin)化学名称为(3,5,7,2′,4′五羟黄酮), 是黄酮类化合物中的一种, 为从黄桑木、 桑橙树和许多中草药中提取的一种浅黄色色素[1]。morin分子的结构特点是含氧的杂环连接两个芳香族环, 具有抗炎[2]、 抗肿瘤[3]及抗氧化[4]等作用。Fang等[5]研究表明, morin可抑制Th1细胞产生的IL12和经LPS/IFNγ活化的巨噬细胞产生的NO, 提示morin具有抑制固有免疫的作用, 然而关于morin使T细胞活化、 增殖作用的研究, 国际、 国内罕见报道。因此, 我们先用刀豆蛋白A(ConA)使T细胞活化、 增殖后, 再以morin进行刺激, 探讨其对T细胞活化、 增殖的影响, 以为其临床应用提供试验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 清洁级BALB/c近交系小鼠, 雄性, 6～8 周龄, 质量(20±2) g, 购自广东省实验动物中心。morin、 ConA、 碘化丙锭(propidium iodide, PI)、 L谷氨酰胺、 β巯基乙醇, 均购自美国Sigma公司。RPMI1640培养基、 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为美国GibcoBRL公司产品。羧基荧光素双醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimide ester, CFDASE)购自美国InvitrogenMolecular Probes公司。PE抗CD3单克隆抗体(mAb)及FITC抗CD69 mAb购自美国BDPharMingen公司。FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠淋巴细胞悬液的制备 将BALB/c小鼠断髓处死, 无菌分离双侧腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅淋巴结和肠系膜淋巴结, 置于盛有预冷的PBS的无菌平皿中, 去掉被膜, 通过200目尼龙网过滤。收集细胞, 加入到冷PBS中以250 g离心5 min, 洗涤细胞2次, 再悬于PBS中。
1.2.2 T细胞早期活化标志CD69表达的检测 采用直接免疫荧光标记法染色。设5个试验组: 对照组(未加ConA和药物刺激), ConA组,（ConA+morin 25 μmol/L）组, （ConA+morin 50 μmol/L）组, （ConA+morin 100 μmol/L）组, 各组细胞培养6 h后, 取细胞悬液并离心浓缩至50 μL, 加入浓度为0.2 mg/mL的PE抗小鼠CD3 mAb和FITC抗CD69 mAb各10 μL, 混匀后, 室温避光30 min。加入冷PBS中, 以250 g离心5 min, 再重悬于300 μL的PBS中, 立即用流式细胞术进行检测。
1.2.3 T细胞增殖的CFDASE染色检测 小鼠淋巴细胞按[6]的方法进行CFDASE染色, 将CFDASE用PBS稀释成2 μmol/L的工作液, 再以PBS调整细胞悬液的密度为2×1010/L, 加入等体积的CFDASE染液(终浓度为1μmol/L), 充分混匀后, 在室温条件下轻轻振荡10 min。然后加入冷PBS中, 以250 g离心5 min, 洗涤细胞2次, 接种于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养基中, 并调整细胞的密度为2×109/L, 于37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。分别收获培养48 h、 72 h的细胞, 加入浓度为0.2 mg/L的PE抗CD3 mAb, 离心洗涤细胞1次, 将细胞重悬于300 μL的PBS中, 用流式细胞术进行检测。
1.2.4 细胞周期的分析 离心收获培养48 h的细胞, 以700 mL/L乙醇固定后, 加入PI溶液(50 mg/L PI、 0.1% Triton X100、 0.1 mmol/L EDTA及50 mg/L RNase A)染色30 min, 然后用流式细胞术分析DNA的含量。
1.2.5 流式细胞术分析 所有样品经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中, 划出淋巴细胞区R1, 在横坐标为PE抗CD3 mAb, 纵坐标为SSC的图中, 划出CD3+细胞区R2, 然后对淋巴细胞上的CD69FITC及CFDASE的荧光强度进行检测。其中CFDASE、 FITC为荧光1(FL1), PE为荧光2(FL2)。每管细胞悬液样品检测10000个细胞, 获得的数据用CELLQuest及ModFit L T 3.2软件进行分析。
1.2.6 统计学处理 全部数据使用均Excel进行处理, 数据以x±s表示, 两组间的比较采用配对t检验。
2 结果
2.1 Morin对T细胞CD69表达的影响 小鼠T细胞培养6 h后, ConA刺激组T细胞的活化率为(72.52±0.66)%与对照组(未经ConA刺激的T细胞)T细胞的活化率(2.97±0.12)%相比较, 差异显著 (P<0.01)。于培养的T细胞中, 加入25 μmol/L、 50 μmol/L、 100 μmol/L的morin与ConA共孵育后, 均可明显抑制ConA介导的CD69分子的表达, 其中, 100 μmol/L的morin的抑制率最强, 检测的T细胞中CD69+ T细胞的比率为(48.95±0.81)%, 与ConA组T细胞的活化率(72.52±0.66)%相比较差异显著(P<0.01, 图1)。
图1 Morin对ConA激活的T细胞表面CD69分子表达的流式细胞术分析（略）
Fig 1 Analysis of morin on CD69 expression on T cells activated with ConA by flow cytometry
2.2 Morin对小鼠T细胞增殖的影响 CFDASE染色后, 在荧光1通道(FL1)中可检测出均一染色的细胞群。根据细胞分裂1次, 其荧光强度倍减一半的原理, 动态追踪了T细胞增殖的情况[7]。用ModFit L T 3.2软件拟合后, 得到增殖的T细胞各代的百分率及增殖指数(PI)。如图2A、 2B所示, 细胞培养48及72 h后, ConA刺激组的细胞分别出现3、 4个子代峰, 加入25、 50及100 μmol/L的morin后, 细胞分裂的代数及PI值均递减(图2C), 其中, 以100 μmol/L morin加药组的抑制作用最明显, 培养48 h的T细胞的PI为(1.02±0.02), 培养72 h的T细胞的PI为(1.03±0.01)。与相应时点ConA刺激组T细胞的PI比较有统计学意义(P<0.01, 图2)。
图2 Morin对ConA刺激的T细胞增殖的影响（略）
Fig 2 Effect of morin on proliferation of T cells stimulated with ConA
A: Representative results for 48 h incubation; B: Representative results for 72 h incubation; C: Statistic results of PI, aP<0.01 vs ConA stimulation group (n=6, x±s).
2.3 Morin 对小鼠T细胞周期的影响 未经ConA刺激的对照组T细胞主要处于G0/G1期; 经ConA刺激后48 h, 与对照组相比较, 处于S期和G2/M期细胞的比率明显增加, 分别为(27.05±0.39)%和(15.93±0.75)%, 而各剂量的morin共孵育组其G2/M期T细胞的比率均明显减少, 其中100 μmol/L的morin共孵育组T细胞的比率最少, 为(8.38±0.43)%; 25 μmol/L及50 μmol/L的morin共孵育组S期T细胞的比率明显增加, 分别为 (30.90±0.59)%和(32.43±0.26)%, 与ConA组相比较具有统计学意义(P<0.01, 表1)。
表1 Morin对ConA刺激后培养48 h 的T细胞细胞周期的影响（略）
Tab 1 The influence of morin on cellcycle of T cells stimulated with ConA for 48 h
aP<0.05, bP<0.01 vs ConA stimulation group.
3 讨论
研究表明, morin可抑制LPS刺激的巨噬细胞的吞噬活性及IL12产生[8], 因此, morin对巨噬细胞吞噬活性和释放IL12的抑制作用, 可能会下调T细胞介导的细胞免疫应答, 但morin是否直接影响T细胞的活化、 增殖有待阐明。本研究以ConA刺激T细胞活化、 增殖后, 用FCM检测了T细胞早期活化标志CD69分子的表达和T细胞的增殖指数(PI)及各代细胞的百分率。研究结果显示, 各浓度的morin对上述指标均有显著地抑制作用, 提示其对T细胞活化的影响可能是通过抑制ConA与细胞膜表面TCR/CD3地交联而激活早期活化相关的蛋白酪氨酸激酶(PTK)Fyn和Lck的活性, 干扰了早期活化事件有关。另外, 也可能是由于对CD69等早期活化抗原表达的抑制而干扰了随后的活化事件, 从而抑制了T细胞的增殖反应。本研究是体外试验, 与Fang等[5]的体内试验用药方法(胃饲给药)不同, 药物浓度比Verbeek等[9]所用的浓度相比较高, 所以有明显的抑制效应。Morin具有抗菌、 抗肿瘤作用。Morin对金黄色葡萄球菌、 杆菌和黄色微球菌等都有抗菌作用[10], 其抗菌机制主要表现为干扰细菌的DNA的合成[11]、 抑制细菌代谢相关的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性和复制型DNA解旋酶RepA的双链DNA解旋活性[12]等。Hsiang等[1]研究发现, morin的抗肿瘤机制为诱导肿瘤细胞在S期中阻滞, 与本研究中morin对T细胞周期影响的结果类似, 提示其可能是通过抑制P38激酶途径而干扰AP1活性, 使之不能发挥作用所致。此外, morin还可通过逆转药物外流运载体P糖蛋白(Pglycoprotein, Pgp)而引起多药耐药效应, 增加抗肿瘤药物在过表达Pgp的肿瘤细胞内蓄积而发挥抗肿瘤作用[13]。药物发挥抗菌、 抗肿瘤的作用, 并不一定与适应性免疫必然相关, 因此本研究的结论中得出的morin对T细胞活化、 增殖的抑制作用与其抗菌、 抗肿瘤作用并无矛盾。同种异基因移植排斥反应, 主要是受者的T细胞介导的移植抗原特异性免疫应答。经典的免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)是通过阻断IL2依赖的T细胞生长和分化而发挥免疫抑制作用, 从而减轻排斥反应的程度, 延长移植物的存活时间。morin能抑制T细胞活化、 增殖, 并将其阻滞于S期, 提示其也是一种有效的免疫抑制剂, 有可能用于移植排斥反应。此外, Fang等[5]的研究表明, morin与CsA可能在药物代谢和药效方面的相互作用而产生一种互补性效应, 即morin不改变被CsA抑制的Th1型免疫应答, 但可通过显著减少组织中CsA的浓度而减轻CsA对正常组织的毒性作用, 提示在应用morin治疗移植排斥方面具有光明的前景。morin能诱导肿瘤细胞在S期中阻滞, 及逆转Pgp引起多药耐药效应, 可以用来治疗由于长期使用抗肿瘤药物而发生耐药现象的肿瘤患者, 或者是应用于器官移植术后的肿瘤病人有肿瘤复发的危险, 既需要使用免疫抑制剂抑制排斥反应又需要抗肿瘤治疗时的情况。morin的免疫药理机制值得进一步研究。
文献:
[1] Hsiang CY, Wu SL, Ho TY. Morin inhibits 12Otetradecanoylphorbol13acetateinduced hepatocellular transformation via activator protein 1 signaling pathway and cell cycle progression[J]. Biochem Pharmacol, 2005, 69(11): 1603-1611.
[2] Galvez J, Coelho G, Crespo ME, et al. Intestinal antiinflammatory activity of morin on chronic experimental colitis in the rat[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2001, 15(12): 2027-2039.
[3] Brown J, O’Prey J, Harrison PR. Enhanced sensitivity of human oral tumours to the flavonol, morin, during cancer progression: involvement of the Akt and stress kinase pathways？[J]. Carcinogenesis, 2003, 24(2): 171-177.
[4] Kitagawa S, Sakamoto H, Tano H. Inhibitory effects of flavonoids on free radicalinduced hemolysis and their oxidative effects on hemoglobin[J]. Chem Pharm Bull (Tokyo), 2004, 52(8): 999-1001.
[5] Fang SH, Hou YC, Chao PD. Pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions of morin and cyclosporine[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2005, 205(1): 65-70.
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[8] Fang SH, Hou YC, Chang WC, et al. Morin sulfates/glucuronides exert antiinflammatory activity on activated macrophages and decreased the incidence of septic shock[J]. Life Sci, 2003, 74(6): 743-756.
[9] Verbeek R, Plomp AC, van Tol EA, et al. The flavones luteolin and apigenin inhibit in vitro antigenspecific proliferation and interferongamma production by murine and human autoimmune T cells[J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(4): 621-629.
[10] Rauha JP, Remes S, Heinonen M, et al. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic compounds[J]. Int J Food Microbiol, 2000, 56(1): 3-12.
[11] Arima H, Ashida H, Danno G. Rutinenhanced antibacterial activities of flavonoids against Bacillus cereus and Salmonella enteritidis[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, 66(5): 1009-1014.
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[13] Zhang S, Morris ME. Effects of the flavonoids biochanin A, morin, Phloretin, and Silymarin on PGlycoproteinmediated transport?[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2003, 304(3): 1258-1267.
2 结果
2.1 Morin对T细胞CD69表达的影响 小鼠T细胞培养6 h后, ConA刺激组T细胞的活化率为(72.52±0.66)%与对照组(未经ConA刺激的T细胞)T细胞的活化率(2.97±0.12)%相比较, 差异显著 (P<0.01)。于培养的T细胞中, 加入25 μmol/L、 50 μmol/L、 100 μmol/L的morin与ConA共孵育后, 均可明显抑制ConA介导的CD69分子的表达, 其中, 100 μmol/L的morin的抑制率最强, 检测的T细胞中CD69+ T细胞的比率为(48.95±0.81)%, 与ConA组T细胞的活化率(72.52±0.66)%相比较差异显著(P<0.01, 图1)。
图1 Morin对ConA激活的T细胞表面CD69分子表达的流式细胞术分析（略）
Fig 1 Analysis of morin on CD69 expression on T cells activated with ConA by flow cytometry
2.2 Morin对小鼠T细胞增殖的影响 CFDASE染色后, 在荧光1通道(FL1)中可检测出均一染色的细胞群。根据细胞分裂1次, 其荧光强度倍减一半的原理, 动态追踪了T细胞增殖的情况[7]。用ModFit L T 3.2软件拟合后, 得到增殖的T细胞各代的百分率及增殖指数(PI)。如图2A、 2B所示, 细胞培养48及72 h后, ConA刺激组的细胞分别出现3、 4个子代峰, 加入25、 50及100 μmol/L的morin后, 细胞分裂的代数及PI值均递减(图2C), 其中, 以100 μmol/L morin加药组的抑制作用最明显, 培养48 h的T细胞的PI为(1.02±0.02), 培养72 h的T细胞的PI为(1.03±0.01)。与相应时点ConA刺激组T细胞的PI比较有统计学意义(P<0.01, 图2)。
图2 Morin对ConA刺激的T细胞增殖的影响（略）
Fig 2 Effect of morin on proliferation of T cells stimulated with ConA
A: Representative results for 48 h incubation; B: Representative results for 72 h incubation; C: Statistic results of PI, aP<0.01 vs ConA stimulation group (n=6, x±s).
2.3 Morin 对小鼠T细胞周期的影响 未经ConA刺激的对照组T细胞主要处于G0/G1期; 经ConA刺激后48 h, 与对照组相比较, 处于S期和G2/M期细胞的比率明显增加, 分别为(27.05±0.39)%和(15.93±0.75)%, 而各剂量的morin共孵育组其G2/M期T细胞的比率均明显减少, 其中100 μmol/L的morin共孵育组T细胞的比率最少, 为(8.38±0.43)%; 25 μmol/L及50 μmol/L的morin共孵育组S期T细胞的比率明显增加, 分别为 (30.90±0.59)%和(32.43±0.26)%, 与ConA组相比较具有统计学意义(P<0.01, 表1)。
表1 Morin对ConA刺激后培养48 h 的T细胞细胞周期的影响（略）
Tab 1 The influence of morin on cellcycle of T cells stimulated with ConA for 48 h
aP<0.05, bP<0.01 vs ConA stimulation group.
3 讨论
研究表明, morin可抑制LPS刺激的巨噬细胞的吞噬活性及IL12产生[8], 因此, morin对巨噬细胞吞噬活性和释放IL12的抑制作用, 可能会下调T细胞介导的细胞免疫应答, 但morin是否直接影响T细胞的活化、 增殖有待阐明。本研究以ConA刺激T细胞活化、 增殖后, 用FCM检测了T细胞早期活化标志CD69分子的表达和T细胞的增殖指数(PI)及各代细胞的百分率。研究结果显示, 各浓度的morin对上述指标均有显著地抑制作用, 提示其对T细胞活化的影响可能是通过抑制ConA与细胞膜表面TCR/CD3地交联而激活早期活化相关的蛋白酪氨酸激酶(PTK)Fyn和Lck的活性, 干扰了早期活化事件有关。另外, 也可能是由于对CD69等早期活化抗原表达的抑制而干扰了随后的活化事件, 从而抑制了T细胞的增殖反应。本研究是体外试验, 与Fang等[5]的体内试验用药方法(胃饲给药)不同, 药物浓度比Verbeek等[9]所用的浓度相比较高, 所以有明显的抑制效应。Morin具有抗菌、 抗肿瘤作用。Morin对金黄色葡萄球菌、 杆菌和黄色微球菌等都有抗菌作用[10], 其抗菌机制主要表现为干扰细菌的DNA的合成[11]、 抑制细菌代谢相关的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性和复制型DNA解旋酶RepA的双链DNA解旋活性[12]等。Hsiang等[1]研究发现, morin的抗肿瘤机制为诱导肿瘤细胞在S期中阻滞, 与本研究中morin对T细胞周期影响的结果类似, 提示其可能是通过抑制P38激酶途径而干扰AP1活性, 使之不能发挥作用所致。此外, morin还可通过逆转药物外流运载体P糖蛋白(Pglycoprotein, Pgp)而引起多药耐药效应, 增加抗肿瘤药物在过表达Pgp的肿瘤细胞内蓄积而发挥抗肿瘤作用[13]。药物发挥抗菌、 抗肿瘤的作用, 并不一定与适应性免疫必然相关, 因此本研究的结论中得出的morin对T细胞活化、 增殖的抑制作用与其抗菌、 抗肿瘤作用并无矛盾。同种异基因移植排斥反应, 主要是受者的T细胞介导的移植抗原特异性免疫应答。经典的免疫抑制剂环孢菌素A(CsA)是通过阻断IL2依赖的T细胞生长和分化而发挥免疫抑制作用, 从而减轻排斥反应的程度, 延长移植物的存活时间。morin能抑制T细胞活化、 增殖, 并将其阻滞于S期, 提示其也是一种有效的免疫抑制剂, 有可能用于移植排斥反应。此外, Fang等[5]的研究表明, morin与CsA可能在药物代谢和药效方面的相互作用而产生一种互补性效应, 即morin不改变被CsA抑制的Th1型免疫应答, 但可通过显著减少组织中CsA的浓度而减轻CsA对正常组织的毒性作用, 提示在应用morin治疗移植排斥方面具有光明的前景。morin能诱导肿瘤细胞在S期中阻滞, 及逆转Pgp引起多药耐药效应, 可以用来治疗由于长期使用抗肿瘤药物而发生耐药现象的肿瘤患者, 或者是应用于器官移植术后的肿瘤病人有肿瘤复发的危险, 既需要使用免疫抑制剂抑制排斥反应又需要抗肿瘤治疗时的情况。morin的免疫药理机制值得进一步研究。
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[1] Hsiang CY, Wu SL, Ho TY. Morin inhibits 12Otetradecanoylphorbol13acetateinduced hepatocellular transformation via activator protein 1 signaling pathway and cell cycle progression[J]. Biochem Pharmacol, 2005, 69(11): 1603-1611.
[2] Galvez J, Coelho G, Crespo ME, et al. Intestinal antiinflammatory activity of morin on chronic experimental colitis in the rat[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2001, 15(12): 2027-2039.
[3] Brown J, O’Prey J, Harrison PR. Enhanced sensitivity of human oral tumours to the flavonol, morin, during cancer progression: involvement of the Akt and stress kinase pathways？[J]. Carcinogenesis, 2003, 24(2): 171-177.
[4] Kitagawa S, Sakamoto H, Tano H. Inhibitory effects of flavonoids on free radicalinduced hemolysis and their oxidative effects on hemoglobin[J]. Chem Pharm Bull (Tokyo), 2004, 52(8): 999-1001.
[5] Fang SH, Hou YC, Chao PD. Pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions of morin and cyclosporine[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2005, 205(1): 65-70.
[6] 肇静娴, 曾耀英, 何贤辉. 活体染料CFDASE在淋巴细胞增殖研究中的应用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2003, 19(2): 109-111.
[7] Fulcher D, Wong S. Carboxyfluorescein succinimidyl esterbased proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory[J]. Immunol Cell Biol, 1999, 77(6): 559-564.
[8] Fang SH, Hou YC, Chang WC, et al. Morin sulfates/glucuronides exert antiinflammatory activity on activated macrophages and decreased the incidence of septic shock[J]. Life Sci, 2003, 74(6): 743-756.
[9] Verbeek R, Plomp AC, van Tol EA, et al. The flavones luteolin and apigenin inhibit in vitro antigenspecific proliferation and interferongamma production by murine and human autoimmune T cells[J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(4): 621-629.
[10] Rauha JP, Remes S, Heinonen M, et al. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other phenolic compounds[J]. Int J Food Microbiol, 2000, 56(1): 3-12.
[11] Arima H, Ashida H, Danno G. Rutinenhanced antibacterial activities of flavonoids against Bacillus cereus and Salmonella enteritidis[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, 66(5): 1009-1014.
[12] Xu H, Ziegelin G, Schrder W, et al. Flavones inhibit the hexameric replicative helicase RepA[J]. Nucleic Acids Res, 2001, 29(24): 5058-5066.
[13] Zhang S, Morris ME. Effects of the flavonoids biochanin A, morin, Phloretin, and Silymarin on PGlycoproteinmediated transport?[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2003, 304(3): 1258-1267.
