RNA干扰抑制MyD88表达对小鼠骨髓树突状细胞生物学活性的影响
作者：陈家军, 孙宗全, 董念国, 苏刚, 刘超, 刘金平, 邓勇志
【关键词】 树突状细胞;,MyD88;,RNA干扰;,脂多糖
Inhibitory effects of RNA interference on MyD88 expression and biological activity in murine myeloid dendritic cells
[Abstract] AIM: To investigate inhibitory effects of RNA interference on MyD88 expression in murine myeloid dendritic cells(DCs) and detect the biological activity of DCs. METHODS: Three pairs of myeloid differentiation factor 88(MyD88) siRNA were synthesized and transfected into DCs by RNAimate. The mRNA and protein expression of MyD88 were analyzed by semiquantified RTPCR and Western blot. Mouse DCs were divided into control group and RNA interference group. One of the highest effective siRNA was transfected into RNA interference group. 12 hours later, LPS of the final concentrations of 10 mg/L was added in two groups and continued to culture for 3 days. The phenotype and functional properties of DCs were detected by flow cytometry and mixed lymphocyte reaction (MLR). The concentration of TNFα, IFNγ and IL12 in the supernatant was detected by ELISA, and the concentration of NFκB was detected by immunochemistry. RESULTS: mRNA and protein expression were reduced 90% and 85% in sequence2 siRNA, 92% and 88% in sequence3 siRNA respectively but no change was found in other groups. LPS stimulation increased the expression of CD80, CD86 and MHCⅡin the cytomembrane of DCs, the concentration of TNFα, IFNγ and IL12 in the supernatant in control group. Besides, LPS stimulation promoted the shift of NFκB to karyon and the proliferation of allogeneic T cells in control group. RNA interference inhibited these effects induced by LPS. CONCLUSION: RNA interference can reduce MyD88 expression in murine myeloid dendritic cells and inhibit the maturation of DCs, which may provide a new strategy of gene therapy for related diseases.
[Keywords]dendritic cells; MyD88; RNA interference; LPS
[摘 要] 目的: 采用RNA干扰技术抑制小鼠骨髓树突状细胞（DC）髓样分化因子88（MyD88）的表达, 并检测其对细胞生物学活性的影响, 为DC的临床应用奠定基础。方法: 针对MyD88基因, 采用化学合成法合成3对MyD88 siRNA（序列1、 序列2及序列3）, 并转染DC2.4 细胞。采用半定量RTPCR及Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测DC MyD88的表达情况, 筛选其中一对高效RNA（序列3）转染DC2.4 细胞（RNA干扰组）, 以未转染RNA的DC2.4细胞作为对照组, 分别给予1mg/L的脂多糖（LPS）刺激。流式细胞术（FCM）检测DC细胞表面CD80、 CD86及MHCⅡ分子的变化, ELISA法检测DC分泌肿瘤坏死因子α（TNFα）、 干扰素γ(IFNγ)和白介素12（IL12）的浓度, 免疫细胞化学检测DC核因子κB（NFκB）的表达, 混合淋巴细胞培养检测T细胞增殖能力, 观察RNA干扰对LPS促DC成熟的影响。结果: 与空白对照组相比, 序列2组及序列3组DC的mRNA和蛋白质表达分别降低90%和85%、 92%和88%, 差异有统计学意义; 脂质体对照组、 无义siRNA对照组及序列1组DC的mRNA和蛋白质表达无显著差异。经LPS刺激后, 与对照组相比, RNA干扰组CD80、 CD86及MHCⅡ分子的表达, TNFα、 IFNγ及IL12的浓度及T细胞增殖能力均显著下降, 且未见明显NFκB核转位。结论: RNA干扰技术能显著下调小鼠DC MyD88的表达, 并显著抑制LPS促DC成熟的效应, 为以DC MyD88为靶向、 相关疾病的基因提供了新思路和手段。
[关键词]树突状细胞; MyD88; RNA干扰; 脂多糖
树突状细胞(dendritic cell, DC) 是体内功能最强的抗原提呈细胞(antigenpresenting cell, APC), 又是惟一能活化初始型T细胞的APC[1]。它活化初始T细胞的能力依赖其成熟状态。最近研究表明, Toll 样受体（TLR）及其信号途径在调控DC的成熟过程中起重要作用,是联结固有免疫和适应性免疫的桥梁[2], 参与了炎症、 肿瘤、 自身免疫性疾病及移植排斥反应等多种病理生理过程。髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）是TLR信号传导过程中重要的转载分子, 它的缺陷可导致TLR信号传导中断, 以MyD88为靶向阻断TLR信号通路可能为治疗上述疾病提供新方法。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是新近发现的基因技术, 可通过双链RNA(dsRNA)介导特异性地降解相应序列的mRNA, 从而导致转录后的基因沉默, 现今被广泛应用于基因功能研究[3, 4], 同时在肿瘤、 病毒性疾病、 心脏病和糖尿病的基因治疗方面具有广阔的前景。我们针对Toll 样受体信号途径中的衔接分子MyD88, 应用RNA干扰技术干预, 观察其对DC表达MyD88的影响, 旨在设计并获得能够特异下调MyD88基因表达的小干扰RNA（small interference RNA, siRNA）, 并进一步观察其对小鼠骨髓DC生物学活性的影响,以期获得耐受性DC, 为DC的临床应用提供新思路和理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料 近交系BALB/c小鼠, 6～10周龄,购自华中科技大学同济医学院器官移植研究所。DC2.4细胞系购于华中科技大学同济医学院细胞工程室, 100 mL/L FCS和RMPI1640培养液为GIBCO公司产品, 辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG抗体及羊抗小鼠IgG抗体(北京中山生物技术有限公司), ECL增强型化学发光显色试剂盒(美国Pierce 公司), RTPCR 试剂盒(晶美公司), BCA 蛋白浓度测定试剂盒(江苏海门碧云天生物技术有限公司), FITC标记的抗小鼠CD80及CD86购自BioLegend公司, FITC标记的抗小鼠MHCⅡ类分子抗体（antimouse IAd）购自PharMingen公司, 小鼠细胞因子定量检测ELISA试剂盒购自晶美公司, 抗小鼠NFκB/P65抗体及MyD88抗体购于LAB VISION 公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的设计及合成 由上海吉玛制药公司化学合成3对siRNA（序列1～3）及一段无义对照siRNA (错配siRNA), 即序列1为sense: 5′GCCUAUCGCUGUUCUUGAA3′, antisense: 5′UUCAAGAACAGCGAUAGGC3′; 序列2为sense: 5′CAGCGAGCUAAUUGAGAAA3′, antisense: 5′UUUCUCAAUUAGCUCGCUG3′; 序列3为: sense: 5′GACUGAUUCCUAUUAAAUA3′, antisense: 5′UAUUUAAUAGGAAUCAGUC3′; 无义对照为sense: 5′UUCUCCGAACGUGUCACGU3′, antisense: 5′ACGUGACACGUUCGGAGAA3′。转染试剂RNAimate为上海吉玛制药公司产品, 所有序列均带有荧光标记。
1.2.2 DC2.4细胞培养及siRNA转染 DC2.4细胞常规培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中, 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养; 每3 d用2.5 g/L胰酶消化传代, 将DC2.4细胞接种于6孔板, 生长至50%～60%融合时分为6组: 空白对照组、 脂质体对照组、 无义siRNA对照组、 序列1组、 序列2组及序列3组。空白对照组不加任何干预措施, 脂质体对照组中仅加入转染试剂RNAimate, 后4组行基因转染。转染方法: 于500 μL的无血清培养基中稀释5 μg siRNA, 加入15 μg RNAimate试剂, 温育30 min使复合物形成; 将上述体系加入含DC2.4细胞的6孔板中, 终体积为2 mL, 细胞继续培养48 h, 荧光显微镜检测转染效率, 并收获细胞提取mRNA和蛋白质。
1.2.3 细胞总RNA 提取和半定量RTPCR 分析MyD88 mRNA的表达 用TRIzol试剂裂解细胞并提取细胞总RNA (按TRIzol说明书操作)[5]。每组取1 μg mRNA用于逆转录反应。MyD88引物正义链: 5′CCTTTATCTGCTACTGCCCCAACGA3′, 反义链: 5′GTGATGAACCGCAGGATACTGGGAAA3′; 内参照GAPDH引物正义链: 5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′, 反义链: 5′TCACCACCCTGTTGCTGTA3′。MyD88、 GAPDH反应条件如下: 94℃、 30 s, 53℃、 30 s, 72℃、 1 min, 退火温度56℃, 余条件相同, 扩增25个循环, 在PCR反应达到平台期之前中止以达到半定量作用。每组取10 μL PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 用凝胶成像分析系统(GENE GENIUS)摄像分析, 依据目的基因PCR产物与GAPDH基因PCR产物灰度比, 判断靶基因的mRNA被siRNA沉寂的程度。
1.2.4 Western blot分析MyD88蛋白质的表达 转染48 h后, 冷PBS溶液洗涤细胞, 各孔加入适量细胞裂解液(100 mmol/L TrisCl pH6.8, 40 g/L SDS, 200 g/L甘油, 即用即加蛋白酶抑制剂leupeptin 10 mg/L, aprotinin 10 mg/L), 冰上孵育20 min, 细胞刮棒刮下并收集裂解物, 超声匀浆, 4℃, 12000 g离心10 min, 取上清保存于-20℃。用BCA法测定蛋白质浓度, 取相同量蛋白质用于100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转移至PVDF膜30 mL/L牛血清白蛋白和50 g/L脱脂奶粉溶液(溶于TBST 缓冲液: 10 mmol/L TrisHCl, pH7.5, 100 mmol/L NaCl, 1 mL/L Tween20)室温封闭2 h, 兔抗MyD88抗体( 1∶1000), 小鼠抗βactin抗体(1∶1000) 4℃孵育过夜, TBST溶液洗膜4次, 每次15 min。室温下相应加入羊抗兔IgG抗体或羊抗小鼠IgG抗体(1∶5000)孵育2 h, 同前法洗膜4次, 用增强化学发光法显色, X光片曝光显影, 凝胶成像分析系统摄像分析。
1.2.5 RNA干扰对DC生物学活性的影响 ①实验分RNA干扰组和对照组。RNA干扰组: 筛选其中一对高效RNA（序列3）以前述方法转染DC2.4 细胞, 12 h后给予1 mg/L LPS刺激。对照组: 以未转染RNA的DC2.4细胞作为对照组, 给予1 mg/L的LPS刺激。两组细胞继续培养3 d。②流式细胞术检测DC细胞表面CD80、 CD86及MHCⅡ分子的变化: 将5×105个DC悬于100 μL PBS, 加入FITC标记的各种单克隆抗体0.5 μL, 4℃避光孵育30 min, 离心弃上清, 加入1 mL PBS清洗细胞1次, 然后将细胞重悬于0.5 mL PBS避光置于4℃, 流式细胞仪(BD公司)检测, CellQuest 软件分析。③ELISA法检测DC分泌TNFα、 IFNγ和IL12的浓度: 收集培养3 d的两组DC上清, 按ELISA 试剂盒说明操作, 每组设3复孔, 检测细胞因子含量。④免疫细胞化学检测DC核因子κB（NFκB）的表达: 实验分空白对照组、 RNA干扰组和对照组, 空白对照组不加任何干预因素, RNA干扰组和对照组的处理同前。参照[6]的方法, 检测各组DC NFκB的表达。⑤混合淋巴细胞反应: 取BALB/c小鼠脾脏, 制备脾细胞悬液, 用淋巴细胞分层液离心获得单个核细胞, 尼龙毛刷法去除黏附细胞, 获得同种异体T细胞作为反应细胞。RMPI1640培养液重悬DC, 加入终浓度为25 μg/L的丝裂霉素C, 37℃孵育45 min, 按照刺激细胞∶反应细胞分别为1∶100, 1∶25 和1∶10的比例, 将DC 和T 细胞置于96孔板混合培养, 其中每孔T细胞数为5×105个, 终体积为200 μL 。每组设3个复孔, 设单纯T细胞组为对照组, 另设空白对照孔。于37℃、 50 mL/L CO2条件下培养3 d, 第3天时加入20 μL MTT, 继续避光孵育2～4 h, 离心去除培养液, 加入100 μL DMSO溶解细胞, 避光放置2 h, 用酶标仪测A570值, 取3孔的平均值作为结果, 刺激指数（SI）, SI＝（实验组A值－空白孔A值）/（对照组A值－空白孔A值）。
1.2.6 统计学分析 所有数据均以x±s表示, 多组间均数比较用单因素方差分析, 独立的两组间均数比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MyD88 siRNA转染DC效率测定 MyD88 siRNA转染DC 48 h后, 荧光显微镜下观察荧光着色细胞与光下细胞数之比即siRNA转染效率, 为80%～85%。
2.2 siRNA 降低MyD88 mRNA的表达水平 与空白对照组相比, 序列2组mRNA表达下降90%, 序列3组mRNA表达下降92%, 差异均有显著的统计学意义(P<0.01)。脂质体对照组、 无义siRNA对照组、 序列1组mRNA 表达分别未见明显下降（图1）。
图1 RTPCR检测各组DC MyD88mRNA的表达变化（略）
Fig 1 MyD88 mRNA expression in DCs detected by RTPCR
1: Marker; 2: Blank group; 3: RNAimate group; 4: Mismatching group; 5: Sequence 1 group; 6: Sequence 2 group; 7: Sequence 3 group.
2.3 siRNA 降低MyD88蛋白质的表达水平 Western blot检测显示, 与空白对照组相比, 序列2组蛋白质表达下降85%, 序列3组蛋白质表达下降88%, 差异均有显著统计学意义(P<0.01)。脂质体对照组、 无义siRNA对照组、 序列1组蛋白质表达分别未见明显下降（图2）。
图2 Western blot检测各组DC MyD88 mRNA的表达变化（略）
Fig 2 MyD88 protein expression in DCs detected by Western blot
1: Marker; 2: Blank group; 3: RNAimate group; 4: Mismatching group; 5: Sequence 1 group; 6: Sequence 2 group; 7: Sequence 3 group.
2.4 RNA干扰对DC表面CD80、 CD86及MHCⅡ分子的影响 流式细胞术结果显示, RNA干扰组CD80、 CD86及MHCⅡ分子的表达明显低于对照组（图3）。
图3 流式细胞术分析RNA干扰对DC表达CD80、 CD86及 MHCⅡ分子的影响（略）
Fig 3 CD80, CD86 and MHCⅡexpression in DCs detected by flow cytometry
2.5 RNA干扰对DC分泌细胞因子的影响 RNA干扰可抑制LPS 刺激引起的Th1型细胞因子(TNFα、 IFNγ、 IL12)的释放, 与对照组相比, 差异有统计学意义（P<0.05）, DC上清液中细胞因子的浓度见图4。
图4 DC上清液中细胞因子的浓度比较（略）
Fig 4 Detection of cytokine in the supernatant by ELISA
2.6 RNA干扰对DC NFκB的影响 免疫细胞化学检测提示空白对照组及RNA干扰组NFκB的表达主要位于胞质, 未见明显核转位。对照组可见NFκB明显转位于细胞核内(图5)。
图5 3组DC NFκB的表达（略）
Fig 5 The expression of NFκB in three groups (×400)
A: NFκB was mainly located in kytoplasm in blank control group; B: NFκB was mainly located in kytoplasm in RNA interference group; C: NFκB was mainly shift to karyon in control group.
2.7 混合淋巴细胞反应 对照组DC有明显刺激同种异体T细胞活化增殖作用, 在浓度比为1∶100时仍有明显作用, 而RNA干扰组DC则不能有效刺激同种异体T细胞活化增殖, 两组SI差异有统计学意义（P<0.01, 表1）。
表1 DC对同种异体T细胞的刺激指数（略）
Tab 1 Stimulation index of DCs in three groups to allogeneic T cell
bP<0.01 vs control.
3 讨论
DC作为最强的专职抗原提呈细胞(APC), 是联结固有免疫和适应性免疫的主要细胞, Toll样受体及其信号途径在DC对免疫应答的调控中起重要作用。多种内外源性配体（如脂多糖、 热休克蛋白等）与TLR 结合导致TLR的聚合而活化, 活化的TLR 胞内尾状结构与衔接分子――MyD88的TLR 受体域结合, MyD88通过其死亡结构域向胞内传递信号, 相继激活IL1R 相关激酶(IRAK)、 肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38及NFκB, 诱导炎症介质产生和共刺激分子表达上调[7], 促进DC成熟, 在炎症、 肿瘤、 自身免疫性疾病及移植排斥反应等多种病理生理过程发挥重要作用, 其中MyD88是最重要的衔接蛋白。由于DC及Toll 样受体信号途径参与了多种病理生理过程, 利用基因技术抑制MyD88的表达, 进而阻断Toll 样受体信号途径具有十分重要的意义。RNA干扰是存在于动植物细胞中的, 由双链RNA（dsRNA）介导的序列特异性的mRNA降解过程[8]。其原理是当dsRNA导入细胞后, 被特异性核酸内切酶识别, 切割成21~23nt长的小片段――小干扰RNA(siRNA)。然后, siRNA 在ATP参与下被RNA 解旋酶解旋为两条单链, 并形成RNA诱导沉默复合体(RISC), 活化后的RISC特异性识别并互补结合同源mRNA序列, 进一步将之切割。最后, 被切割成片段的mRNA再被核酸外切酶进一步降解, 从而在翻译水平干扰基因表达。与其他几种进行功能丧失或降低突变的技术相比, RNAi 技术具有高效性、 特异性。我们根据MyD88基因序列的特点, 在线设计了针对MyD88的3对siRNA, 化学合成后用脂质体转染法, 将siRNA转染小鼠DC2.4细胞, 荧光显微镜观察荧光着色细胞与自然光下细胞数之比为80%～85%, 证明转染试剂RNAimate具有高效性; 半定量RTPCR、 Western blot及免疫组化法结果显示: 在RNA水平和蛋白水平的研究结果基本一致, 序列2及序列3均可显著抑制MyD88的合成, 其中序列3基因沉默效率最高。我们研究了脂多糖刺激对DC成熟状态的影响, 结果显示, 未转染siRNA的DC经LPS刺激后其表面共刺激分子CD80、 CD86及MHCⅡ分子均上调, 分泌Th1型细胞因子TNFα、 IFNγ及IL12明显增多, 免疫细胞化学显示NFκB也从胞质转位至核内（NFκB的活化是DC成熟的标志之一）, 混合淋巴细胞培养检测示T细胞增殖能力提高, 提示LPS可通过激活TLR 信号传导通路促进DC成熟, 激活特异性免疫反应, 与以往研究结果一致[9]。我们还研究了RNA干扰对DC 生物学活性的影响。MyD88 siRNA转染DC后给予 LPS刺激, 检测发现DC共刺激分子CD80、 CD86、 MHCⅡ分子及Th1型细胞因子均无明显上调, NFκB核移位被抑制, 刺激T细胞增殖能力下降, 说明MyD88 RNA干扰可抑制MyD88的合成进而阻断DC内的信号传导, 抑制DC成熟, 增强DC的免疫耐受诱导作用。 本实验结果表明, RNA干扰可显著抑制DCMyD88的表达, 进而阻断TLR信号的转导, 抑制DC成熟, 产生耐受性DC, 从而为临床应用耐受性DC败血症、 移植排斥反应、 自身免疫性疾病及慢性炎性疾病提供新思路。可以推测, 采用MyD88 RNA干扰技术阻断TLR信号通路将是治疗上述疾病很有前途的措施。
文献:
[1] Stuart LM, Lucas M, Simpson C, et al. Inhibitory effects of apoptotic cell ingestion upon endotoxindriven myeloid dendritic cell maturation[J]. J Immunol, 2002, 168(4): 1627-1635.
[2] Schnare M, Barton GM, Holt AC, et al. Tolllike receptors control activation of adaptive immune responses[J]. Nat Immunol, 2001, 2(10): 947-950.
[3] Elbashir SM, Harborth J, Weber K, et al. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs[J]. Methods, 2002, 26(2): 199-213.
[4] 饶 林, 詹林盛, 彭剑淳, 等. siRNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达[J]. 生物化学与分子生物学报, 2004, 20 (1): 38-43.
[5] Huang D, Chen WT, Zhang ZY, et al. Identification of genes with consistent exp ression alteration pattern in ACC2 and ACCM cells by cDNA array[J]. Chin Med J(Engl), 2003, 116(3): 448-452.
[6] Yang DL, Xu YJ, Zhang ZX, et al. Effect of nitric oxide on NFκB activation induced by cigarette smoke extract in rat alveolar macrophage[J]. Chin J Cell Mol Immunol, 2003, 19(1): 7-9.
[7] Bulut Y, Faure E, Thomas L, et al. Chlamydial heat shock protein 60 activates macrophages and endothelial cells through Tolllike receptor 4 and MD2 in a MyD88dependent pathway[J]. J Immunol, 2002, 168(3): 1435-1440.
[8] Hannon GJ. RNA interference[J]. Nature, 2002, 418(6894): 244-251.
[9] Michelsen KS, AicherA, Mohaupt M, et al .The Role of Tolllike Receptors (TLRs) in Bacteriainduced Maturation of Murine Dendritic Cells (DCs)[J]. J Biol Chem, 2001, 276(28): 25680-25686.
