人IL
作者：孙杰, 李伯安, 戚扬, 周继文, 朱雷, 迟淑萍, 程云
【关键词】 IL
Cloning, expression and identification of human interleukin10 gene
[Abstract] AIM: To construct a prokaryotic expression vector containing human interleukin10 (IL10) gene, express and identify the protein. METHODS: Human IL10 gene from HepG2 was isolated and identified by DNA sequencing, and then cloned into the expression vector PET28 a (+) to construct prokaryotic expression vector. The recombinant protein was expressed in BL21(DE3) and identified by Western blot and ELISA. RESULTS: The expressed protein was mainly located in the inclusion body. The relative molecular mass of the expressed product was identical to that of prediction. The expressed protein had binding activity with specific antibody. CONCLUSION: The human IL10 gene was successfully cloned and expressed in E.coli. The expressed product had antigenicity which provides foundation for preparation of monoclonal antibodies against IL10.
[Keywords]IL10; cloning; prokaryotic expression
[摘 要] 目的: 构建含人IL10全基因序列的原核表达载体, 并进行表达及产物活性的鉴定。方法: 利用RTPCR方法, 从人肝癌细胞系HepG2的总RNA中扩增IL10的全长编码序列。编码序列经测序验证后, 将其克隆入表达载体PET28 a（+）, 构建IL10基因的重组原核表达载体。在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白, 表达产物采用Western blot和ELISA进行鉴定。结果: 表达产物主要位于包涵体内。经Western blot分析和ELISA检测显示, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期的结果相符, 有结合抗体活性。结论: 成功地扩增人IL10全基因序列, 并构建了含该基因序列的原核表达载体, 在大肠杆菌中高效表达的表达产物具有抗原活性, 为下一步制备抗IL10的单克隆抗体(mAb)提供了必要的前提。
[关键词]IL10; 克隆; 原核表达
IL10也叫细胞因子合成抑制因子, 主要由Th2细胞、 巨噬细胞及活化的B细胞产生, 具有维持机体免疫反应稳定, 抑制病原体引起对机体有害炎症反应的功能[1]。IL10是含有178个氨基酸残基(其中N端的18个氨基酸为信号肽序列)相对分子质量(Mr)约为18000的酸性糖蛋白。其成熟形式含有160个氨基酸, 活性形式通常是以二硫键形成的Mr约为39000的二聚体, 含有两个N糖基化位点。为进一步探讨IL10的生物学活性及其与疾病发生防治的关系, 我们从人肝癌细胞系HepG2中扩增了IL10全长基因编码序列, 成功地构建了IL10基因的原核表达载体, 并对表达产物进行了鉴定。
1 材料和方法
1.1 材料 HepG2细胞及大肠杆菌DH5α、 BL21(DE3)均为本室保存。pGEMT、 PET28质粒购自Promega公司。各种限制性内切酶, 连接酶, Taq DNA聚合酶, dNTP、 PCR产物及质粒纯化试剂盒, 均为Promega公司产品。总RNA提取试剂Trizol购自Gibco公司。IPTG为Sigma公司产品。检测IL10的试剂盒购自晶美试剂公司。兔抗IL10血清为301颜光涛教授惠赠。HRP羊抗兔IgG购自中杉金桥公司。寡聚核苷酸引物由北京三博远志公司合成。扩增IL10基因的引物设计根据GenBank中登录的IL10的基因序列而设计。
1.2 方法
1.2.1 IL10的RTPCR 按照Trizol操作指南, 从HepG2细胞中提取总RNA, 用 RTPCR扩增IL10全长基因。以DNAMan软件分析设计的两对引物的序列, 1F: 5′AAC CAA ACC ACA AGA CAG AC3′, 1R: 5′AGA GTC TAT AGA GTC GCC ACC3′, 2F: 5′CGC GGA TCC ATG CAC AGC TCA G3′(虚线处为BamH I的酶切位点, 实线为启动密码子), 2R: 5′CCG GAA TTC TCA GTT TCG TAT CTT CA3′(虚线处为EcoR I的酶切位点, 实线为反义终止密码子)。其中1F、 1R为外引物, 2F、 2R为内引物。首先用1R引物进行反转录获得cDNA, 然后加入1F引物进行第1轮PCR, 以PCR产物为模板用内引物进行PCR扩增基因目的片段。
1.2.2 RTPCR产物的克隆与鉴定 RTPCR产物经回收试剂盒回收, 与质粒pGEMT easy载体连接后, 转染感受态大肠杆菌DH5α。挑选重组质粒扩大培养后,采用质粒小量提取试剂盒提取质粒, 以BamH I和EcoR I进行酶切鉴定。将阳性克隆命名为pGEMIL10送奥科公司进行序列测定。
1.2.3 IL10基因表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达 将回收后的PCR产物与表达载体PET28a(+)均进行双酶切后连接并转染感受态大肠杆菌BL21(DE3)［2］, 挑选重组载体命名为PET28IL10, 挑取单菌落,接种于含有卡那霉素（Kan）的LB液体培养基中, 于37℃振荡过夜。次日按1%菌液浓度转种于200 mL含有卡那霉素（Kan）的LB液体培养基中, 于37℃振荡增菌(A600＝0.4～0.6)。经对诱导条件进行优化后, 确定于37℃以1 mmol/L IPTG诱导4 h, 以未诱导重组体作阴性对照。收获菌液经超声裂解后, 进行120 g/L SDSPAGE[3], 用考马斯亮蓝染色。
1.2.4 目的蛋白的初步纯化 大量培养含有表达载体PET28a(+)IL10的BL21(DE3) 重组菌, 经IPTG诱导表达后, 超声破菌离心, 收获沉淀进行120 g/L SDSPAGE。将目的蛋白带切下, 置0.02 mol/L PBS浸泡, 浓缩浸泡液即为纯化的目的蛋白。
1.2.5 表达目的蛋白的鉴定 （1）活性检测: 以未诱导的重组菌裂解产物作为阴性对照, 用检测 IL10的ELISA试剂盒对纯化的表达蛋白进行检测, 每一反应孔均进行复孔实验。操作步骤按试剂操作手册。于波长450 nm处测定光吸收（Ａ）值。（2）与兔抗IL10血清的反应［4］: 用纯化的4 mg/L目的蛋白包被ELISA板, 检测稀释的兔抗IL10血清, 以1∶10正常兔血清作为阴性对照, HRP羊抗兔IgG作为二抗。于波长450 nm处测定光吸收(A)值。（3）Western blot鉴定［2］: 将裂解菌的沉淀包涵体、 纯化的目的蛋白及空质粒诱导物, 进行120 g/LSDSPAGE后, 转移到硝酸纤维素膜上。经100 mL/L小牛血清-PBS于4℃封闭过夜后,依次加入兔抗IL10 抗体37℃孵育1 h, 洗涤后加入HRP羊抗兔IgG（孵育及洗涤同前）加入DAB显色后观察结果。
2 结果
2.1 IL10基因PCR产物的电泳分析 用RTPCR扩增得到的基因片段在DNA电泳图上约为555 bp (图1)。经与GenBank中登录的IL10基因的大小比对完全一致, 初步认为该序列是IL10全基因序列(包括信号肽)。
图1 IL10基因RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳分析（略）
Fig 1 Agarose gel electrophoresis analysis of the RTPCR product of IL10 gene
1: Empty plasmid/BamH I+EcoR I; 2: RTPCR product of IL10 gene; 3: RTPCR negative control(without IL10 template); 4: Recombinant plasmid pET28a(+)IL10/BamH I+EcoR I; 5: DL2000 marker.
2.2 重组质粒的鉴定及序列测定 重组质粒进行DNA序列分析后证实与国外报道的IL10基因的序列相一致。阳性重组质粒经BamH I和EcoR I双酶切后, DNA电泳可见555 bp的酶切带（图1）, 同预期的结果一致, 再次证明该插入片段为IL10全长基因。
2.3 重组蛋白的诱导表达 重组菌于37℃经1 mmol/L IPTG诱导4 h, 收菌超声裂解后, 进行120 g/L SDSPAGE 结果显示诱导全菌的裂解液在Mr约25400处可见明显的目的蛋白表达带, 表达产物主要位于沉淀包涵体内, 上清中含量少。未转染的E.coli BL21(DE3)和空质粒转染诱导后菌的裂解液均未见目的蛋白的表达带（图2）。
2.4 纯化目的蛋白纯度的鉴定 切胶纯化后, 进行120 g/L SDSPAGE结果显示, 可见在Mr约为25400处出现单一的目的蛋白表达带, 纯度很好（图2）。用紫外分光光度计测定蛋白的浓度为1.3 g/L。
图2 表达蛋白SDSPAGE分析（略）
Fig 2 SDSPAG analysis of expressed target protein
1: Purified target protein; 2: E.coli BL21(DE3) expressed protein; 3: pET28a(+)expressed protein; 4: Supernatant of lysate of induced bacteria; 5,6: Inclusion body; 7: Total protein of induced bacteria; 8: Protein marker.
2.5 表达蛋白活性的鉴定 （1）随纯化的表达蛋白倍比稀释, A值呈剃度下降。稀释度为1∶25600仍能检测到阳性结果, 见表１。大于2.1倍阴性A值判定为阳性。（2）兔抗IL10血清在1∶6400稀释后仍能与纯化的目的蛋白出现特异结合反应。大于2.1倍的阴性A值判定为阳性。（3）Western blot分析显示, 沉淀包涵体及纯化的目的蛋白均可与兔抗IL10抗血清出现特异性结合反应带; 空质粒转染的E.coli BL21(DE3)诱导后未出现蛋白带(图3), 结果表明表达蛋白具有很好的反应活性。
图3 表达蛋白的Western blot 分析（略）
Fig 3 Western blot analysis of expressed protein
1: Protein marker; 2: Purified target protein; 3: Inclusion body; 4:The protein expressed in emptytransformed E.coli BL21(DE3).
3 讨论
调节炎症反应对于一个具有生命力的有机体具有非常重要的作用。IL10是一个通过调节髓来源细胞而发挥对免疫和炎症反应重要影响的多功能细胞因子。血清中IL10水平与某些疾病的严重程度具有一定的相关性。IL10用于临床慢性炎症性疾病的手段, 可降低炎症的严重程度［5］, 从而保护组织器官减少损伤。因此, 研究IL10对临床的诊断和治疗都具有重要的实用价值。本研究中, 我们扩增了IL10 的全基因（包括信号肽）, 并进行了克隆、 测序及原核表达。扩增的IL10全基因片段的大小为555 bp。与GenBank中登录的IL10基因序列相一致。由于E.coli是当前较广泛的原核表达体系, 具有培养方法简单、 快速、 等优点。而真核表达体系虽具有转录和翻译后的加工机制, 但操作技术难、 费时、 不经济等为真核表达带来困难［6］, 所以在本研究中选择E.coli来表达IL10基因。以PET28a(+)IL10重组载体转染E.coli BL21(DE3) 经IPTG诱导表达蛋白Mr约为25400。表达的目的蛋白经SDSPAGE鉴定同预期的结果一致, 表达产物主要为包涵体, 包涵体的形成主要是目的蛋白高水平表达的结果［7］。在表达产物的初步纯化过程中, 本试验中没有采用将包涵体变性、 复性处理等繁琐步骤, 而是进行SDSPAGE分离后切取目的蛋白再经PBS浸泡获得目的蛋白。用SDSPAGE和Western blot 等方法对纯化目的蛋白进行鉴定显示纯度很好。这一简单的制备纯化蛋白的方法大大节省了经费,简化了操作。纯化的目的蛋白经SDSPAGE及Western blot等分析表明, 该表达蛋白可与兔抗IL10抗体特异性结合且纯度和抗原活性都很好, 为制备抗IL10mAb, 进一步应用于临床诊断奠定了必要的物质基础。
文献:
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