Knockout血清替代品可提高C57BL/6J小鼠胚胎干细胞建系效率
作者：王宏, 田海滨, 陈娟, 沙红英, 陈建泉, 成国祥
【关键词】 knockout血清替代品;,C57BL/6J小鼠;,胚胎干细胞;,建系效率
Knockout serum replacement improves establishment efficiency of C57BL/6J mouse embryonic stem cell line
[Abstract] AIM: To eliminate the influence of serum on selfrenewal of embryonic stem cells (ESCs), knockout serum replacement (KSR), a defined formulation, was used to replace serum for the establishment of C57BL/6J mouse ESC line. METHODS: C57BL/6J mouse blastocysts collected at 3.5 days post coitum (d.p.c.) were cultured in the medium supplemented with KSR. In control experiment, KSR was substituted by fetal bovine serum (FBS). When ESC line was established, the morphology of ESCs, the expression of alkaline phosphatase and oct4, and the karyotype and differentiating ability of ESCs were analyzed. RESULTS: 13 blastocysts were cultured in the medium supplemented with KSR and one ESC line (MES1) was established with a normal and stable XX karyotype after cultured for more than 20 passages, and then the high expression of alkaline phosphatase and oct4 was detected. When cultured in suspension, MES1 formed embryoid bodies. When inoculated subcutaneously into nude mice, MES1 formed teratoma. After injected into ICR mouse blastocysts collected at 35 d.p.c., MES1 incorporated into the inner cell mass of the host blastocyst and contributed to the development of a chimera. In control experiment, no ESC lines were cultured for more than 3 passages. CONCLUSION: KSR can be efficiently used to isolate and culture C57BL/6J mouse ESCs, which can eliminate traditional prescreening of FBS suitable for isolation and culture of ESCs.
[Keywords]knockout serum replacement; C57BL/6J mouse; embryonic stem cells; establishment efficiency
[摘 要] 目的: 在培养液中添加knockout血清替代品(knockout serum replacement, KSR)代替胎牛血清(FBS)用于建立C57BL/6J小鼠胚胎干细胞（ESC）细胞系, 以便消除血清中的不确定因子对ESC增殖的影响。方法: 以C57BL/6J小鼠3.5 d的囊胚为材料分离ESC, 比较KSR和FBS用于建立小鼠ESC细胞系的效率, 并通过体内、 外分化验证所分离获得的小鼠ESC 的发育潜能。结果: 培养液中添加KSR, 成功从13个小鼠囊胚中分离获得一个ESC细胞系(MES1), 体外培养传代超过20代仍保持未分化状态, 核型为正常XX型,碱性磷酸酶及oct4基因高表达, 悬浮培养可以生成拟胚体, 接种到裸鼠皮下可形成畸胎瘤, 注射到ICR小鼠3.5 d囊胚中, ESC可以参与胚胎发育并产生嵌合体小鼠。而培养液中添加FBS的对照组未能获得超过3代的ESC细胞系。结论: 在培养液中添加KSR代替FBS适合于C57BL/6J小鼠ESC的分离与培养, 从而可避免实验前对所用血清的筛选。
[关键词]knockout血清替代品; C57BL/6J小鼠; 胚胎干细胞; 建系效率
小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)细胞系最早是在1981年由Evans和Kaufman以小鼠囊胚为材料, 体外培养分离获得。近年来, 由于小鼠ESC具有胚胎嵌合和生殖系嵌合能力[1]以及在特定条件下可定向分化[2, 3]等的特性, 因此在早期胚胎发育研究[4]、 基因打靶技术的改进[5]和利用细胞移植进行疾病的[6]等研究领域得到了广泛的应用。然而影响小鼠ESC分离培养的因素很多, 很关键的一点是血清的质量[7]。实验室一般是先筛选出适合ESC生长的血清, 大量购置, 冻存备用, 这必然使实验操作较为繁琐。Knockout血清替代品(knockout serum replacement, KSR)是一种人工合成产品, 成份明确, 质量易于控制,因而应用该血清替代品将可避免实验前对血清的筛选。本研究中成功地以KSR替代胎牛血清(FBS)从C57BL/6J小鼠35 d囊胚分离获得ESC, 并可长期传代。分离获得的ESC发育多能性通过体内外分化以及嵌合体小鼠的制备得到验证。而采用FBS的对照组未能获得超过3代的ESC细胞系。从而证实KSR适合于C57BL/6J 小鼠ESC的分离与培养。
1 材料和方法
1.1 材料 细胞培养液DMEM, knockout DMEM, 细胞培养用PBS、 谷氨酰胺、 胰蛋白酶/EDTA、 青霉素、 链霉素、 秋水仙素、 非必需氨基酸、 FBS、 KSR以及Trizol试剂, 均为Gibco公司产品。明胶、 2巯基乙醇、 低熔点琼脂糖、 重组鼠白血病抑制因子（LIF）、 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、 底物DAB、 碱性磷酸酶染色试剂盒、 Giemsa染色液均为Sigma公司产品。丝裂霉素C为CalBiochem公司产品。反转录试剂盒购于Promega公司。抗体均购于Neomarkers公司。引物由宝生物工程有限公司合成。实验中C57BL/6J小鼠、 ICR小鼠、 裸鼠均购自上海实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 饲养层的制备 取135 d的ICR小鼠胚胎, 按常规方法制备原代小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblasts, MEF), 培养液为DMEM, 内含2 mmol/L谷氨酰胺、 100 mL/L FBS、 100 U/mL青霉素、 100 μg/mL链霉素。待细胞长满后, 在培养液中加入终浓度10 mg/L的丝裂霉素C, 处理2、 3 h。经PBS清洗5次, 用2.5 g/L胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA消化, 按1×105/cm2密度将细胞接种到预先涂有1 g/L明胶的4孔板中备用, 用前更换培养液。
1.2.2 ESC细胞系的建立 收集35 d的C57BL/6J小鼠囊胚培养在制好的饲养层上, 培养液为Knockout DMEM, 内含150 mL/L KSR、 2 mmol/L谷氨酰胺、 0.1 mmol/L非必需氨基酸、 0.1 mmol/L 2巯基乙醇、 100 U/mL青霉素、 100 μg/mL链霉素、 1000 U/mL LIF和10 ng/mL bFGF, 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。4、 5 d后, 内细胞团（inner cell mass, ICM）细胞增殖旺盛, 此时将ICM离散成小的细胞团块, 接种到预先制好的饲养层上。5~8 d后, 出现的ESC集落可供建立ESC细胞系。以后每2、 3 d传代1次。对照组中培养液内用150 mL/L FBS替代KSR。
1.3 碱性磷酸酶活性检测 取指数生长期ESC, 用碱性磷酸酶染色试剂盒对ESC集落染色。
1.4 核型分析 用玻璃针挑取ESC集落, 经2.5 g/L胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA消化成单个细胞后, 接种到1 g/L明胶包被的培养皿内, 待细胞丰度达80%时, 用0.4 μg/mL秋水仙素处理3 h, 常规空气干燥法制片, 0.25 g/L胰蛋白酶消化2~6 min, Giemsa染色。
1.5 Oct4基因的表达检测 用Trizol试剂法从106个ESC中提取总RNA, 反转录试剂盒反转录得cDNA第1链。经PCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳分析oct4基因的表达。引物为: 5′GGCTGGACACCTGG CTTC和5′GCTCCAGGTTCTCTTGTCTAC, PCR条件为: 95℃ 4 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30循环; 72℃ 10 min。
1.6 ESC体外分化 取处于指数生长期的ESC集落, 用25 g/L胰蛋白酶/053 mmol/L EDTA消化, 轻轻吹打成小的细胞团块, 离心去掉消化液。用不添加LIF和bFGF的ESC培养液按1×109/L密度重悬细胞, 转移到铺有10 g/L低熔点琼脂糖的培养皿内, 4 d后, 有拟胚体（embryonic bodies, EB）出现。将EB接种到铺有明胶的培养皿内培养, 7 d后进行常规免疫组织化学染色, 一抗为抗肌肉特异性肌动蛋白(小鼠IgG, 1∶100), 二抗为HRP标记的兔抗鼠IgG (1∶100), 底物为DAB。阴性对照组以001 mol/L PBS 代替一抗。
1.7 ESC体内分化 将1×106个ESC接种到裸鼠皮下, 2周后即可观察到畸胎瘤的出现, 5周后手术取畸胎瘤按常规方法制成石蜡切片, 经苏木精、 伊红染色后镜检。
1.8 嵌合体小鼠的制作 将指数生长期的ESC集落消化成单个细胞, 去掉饲养层细胞后, 用显微注射的方法将ESC注射到35 d的ICR小鼠囊胚腔中, 1~3 h后, 移入假孕ICR母鼠子宫, 观察出生后的小鼠, 判断有无毛色嵌合。
2 结果
2.1 小鼠ESC分离与培养 手术获得33个35 d的C57BL/6J小鼠囊胚, 13个培养在添加KSR的培养液中, 20个培养在添加FBS的培养液中。12~24 h后, 大多数胚胎开始从透明带中孵化出来并开始贴壁, 24~48 h后, 滋胚层细胞逐渐长出, 并将饲养层细胞推开。同时ICM开始增殖, 4、 5 d后, 形成山丘状隆起（图1A）, 此时将增殖的ICM细胞离散成小的细胞团块接种到新制备的饲养层上。2 d后, 开始出现各种分化的细胞, 这包括滋胚层样细胞, 上皮样细胞, 4 d后可见ESC集落, 细胞排列紧密, 界限不清, 集落边缘折光性强。5~8 d后, 将ESC集落离散成单个细胞传代, 3 d后, 即有大量的集落长出（图1B）, 以后每2、 3 d传代1次。在添加KSR的培养液中获得了一个可以连续传代的细胞系MES1, 传代超过20代仍保持未分化状态。而对照组中未能获得传代超过3代的细胞系（表1）。对传至第20代的MES1细胞集落进行碱性磷酸酶染色呈强阳性（图1C）。
表1 KSR和FBS对小鼠ESC分离培养的影响（略）
Tab 1 Effect of KSR and FBS on isolation and culture of mouse ESCs
A: Medium supplemented with KSR; B: Medium supplemented with FBS.
图1 小鼠ESC (MES1)细胞特征（略）
Fig 1 Characterization of murine ESC (MES1)
A: Colony of ICM; B: Colonies of undifferentiated ESCs; C: Alkaline phosphatase activity in MES1. Scale bar corresponds to 50 μm.
2.2 核型分析 核型分析结果显示MES1为XX型, 具有正常40条染色体（图2）。
图2 MES1细胞分裂中期的染色体图谱（略）
Fig 2 A metaphase spread of MES1 that included two X chromosomes (arrow, ×1000)
2.3 oct4基因表达检测 RTPCR结果显示, MES1细胞中oct4基因处于高表达水平（图3）。
图3 RTPCR检测MES1细胞中oct4基因的表达（略）
Fig 3 RTPCR analysis of the expression of oct4 gene in MES1
2.4 ESC体外分化 收集部分传至20代的MES1, 培养在铺有10 g/L低熔点琼脂糖培养皿中, 细胞集落可以自发地相互聚集, 4 d后即有球形EB形成（图4A）。将EB接种到涂有1 g/L明胶的培养皿内, 12 h后, EB贴壁生长, 5~7 d后可见跳动的心肌细胞。免疫组织化学染色呈阳性（图4B）, 2周后可见一些上皮样结构（图4C）及成串排列的内皮细胞（图4D）。
2.5 ESC体内分化 收集部分传至20代的MES1细胞接种到4只裸鼠体内, 有1只长出畸胎瘤, 5周后取出畸胎瘤, 经HE染色后, 显微镜下可见广泛的分化组织, 如: 神经上皮（图5A）、 管状结构（图5B）、 软骨（图5C）、 脂肪组织（图5D）、 肌肉组织（图5F）等。
图4 MES1体外分化结果（略）
Fig 4 Differentiation potency of MES1 in vitro
A: EB; B: Immunostaing with antibody against the musclespecific antigen actin; C: Differentiating into epithelial cells; D: Differentiating into endothelial cells. Scale bar corresponds to 50 μm.
图5 形成的畸胎瘤含有广泛的分化组织（略）
Fig 5 Differentiation of various tissues in teratomas
A: Neural epithelium; B: Gutlike structures; C: Cartilage; D: Adipocytes; E: Muscle. Scale bar corresponds to 50 μm.
2.6 嵌合能力检验 实验中共操作了76枚胚胎, 移植了5只受体, 其中3只受孕, 受孕率60%。1只母鼠生了2只幼鼠, 但未存活; 1只母鼠生了4只幼鼠, 存活1只; 另一只生了5只幼鼠全部存活, 其中有1只雄性小鼠为嵌合鼠（图6）。
图6 将MES1细胞注射到ICR小鼠囊胚获得嵌合小鼠（略）
Fig 6 Chimeric animal obtained after injecting MES1 into ICR blastocyst
3 讨论
建立小鼠ESC细胞系的关键问题: 一是促进ESC分裂增殖, 另一是抑制其分化。培养液中加入FBS可以满足其生长需求, 但血清中的一些不确定因子在维持其增殖的同时, 也会激活ESC分化的开关, 使其丧失发育的多能性, 特别是由于动物个体之间的差异, 厂家生产的每一批次的血清都存在差异, 因此不同批次的血清并非都适合ESC建系, 本研究采用FBS未能获得可长期传代的小鼠ESC细胞系也证实了这一点。因而, 在传统操作中, 实验前检测所购置的血清是否适合ESC建系是至关重要的。KSR是人工合成的, 成分比较明确, 本研究证实在培养液中添加KSR可以有效地维持C57BL/6J小鼠ESC的未分化状态, 与对照组相比提高了ESC的建系效率, 从而避免了实验前对血清的筛选工作, 简化实验操作。在传代过程中, 细胞增殖速度不仅受到外界因素的影响, 相互之间也会产生促进效应。本实验中, ESC传代初期,细胞数量较少, 干细胞增殖速度较慢, 需要培养较长时间才可传代, 而后期细胞数量较多, 因而只需2、 3 d就可传代1次。传代时机的把握对于ESC能否顺利传代也很重要。本实验中除观察细胞形态外, 主要采用了碱性磷酸酶和oct4基因的表达检测来验证MES1的胚胎细胞特性。碱性磷酸酶在胚胎细胞内广泛表达, 分离获得的多种哺乳动物ESC都表达该酶活性[1, 8, 9], 而且往往该酶活性高的ESC才具有更广泛的分化能力[9]。实验中对传至第20代的MES1细胞集落染色, 结果呈强阳性, 这说明MES1在传代过程中仍保持有胚胎细胞的特性。小鼠oct4基因最初在卵裂球的各细胞中均表达, 在囊胚期ICM形成的过程中只限于ICM, 在滋养外胚层和原始内胚层表达下调。随后在原肠形成时只限于外胚层且表达下调, 发育的后期只在原始生殖细胞中表达[10], 该基因已被作为鉴定ESC的标志基因。本实验中, oct4基因高水平表达说明了MES1类似于具有发育多能性的胚胎细胞, 进一步证明其胚胎细胞特性。ESC发育多能性是指ESC可以分化成各种体细胞, 包括生殖细胞。体外验证方法一般采用悬浮培养产生EB, EB内含有多种分化类型的细胞。本研究所分离获得的ESC体外悬浮培养可生成EB, EB贴壁生长, 可分化出上皮样（外胚层）、 心肌（中胚层）、 内皮样细胞（内胚层）, 说明ESC具有分化的多能性。而EB贴壁生长产生跳动心肌细胞这一现象类同内细胞团的早期发育。特别是EB贴壁后, 5-7 d出现跳动的心肌细胞, 其出现的时间与小鼠胚胎发育过程中心肌的出现极其相似, 因而可作为研究胚胎早期发育的模型。体内分化研究过程中, 所获得的畸胎瘤中存在多种组织细胞, 如一些管状结构、 神经样组织、 肌肉组织, 这进一步证明所分离获得的小鼠ESC具有分化发育成源于3个胚层的组织细胞类型的能力。嵌合鼠的获得证明所建小鼠ESC细胞系具有胚胎嵌合能力, 但所生的一只嵌合鼠未能发生生殖系嵌合, 有待于进一步验证所获得的小鼠ESC是否具有生殖系嵌合能力。然而即使没有生殖系嵌合能力, 其具有的分化多能性这一特点, 使其也可作为体外研究细胞谱系决定的模型; 以及用于体外分化成某种特定类型细胞的研究, 为通过细胞移植人类疾病的研究奠定基础。最重要的, 通过本次实验研究证实KSR可替代FBS用于小鼠ESC的分离培养并能有效提高ESC建系效率, 分离获得的ESC具有分化的多能性且具备小鼠ESC典型特征。因而在小鼠ESC分离建系过程中采用KSR可避免实验前血清的筛选工作,达到简化实验操作的目的。
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