间充质干细胞免疫调控功能研究新进展
【摘要】 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞的一种。近年来的相关研究表明， MSC具有低免疫原性，它可以通过抑制淋巴细胞的增殖、抑制抗原呈递细胞分化成熟及功能发挥、抑制CTL形成、增加调节性T细胞比例等多种途径发挥免疫调节作用。体内实验证明，MSC输注能够延长狒狒异体皮肤移植的存活时间，可减轻小鼠实验性自体免疫性脑脊髓膜炎。在临床上，MSC应用于异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的预防和效果显著。本文对MSC的免疫学特性及其在体内外试验中发挥的免疫调控功能的研究进展进行了综述。
【关键词】 移植物抗宿主病
Recent Advance in Research on Immunomodulatory Function of Mesenchymal Stem Cells ——Review
Abstract Mesenchymal stem cells (MSCs) are a kind of adult stem cells which have the capability to differentiate into multiple cell types as well as self?renew continuously. Recent studies demonstrate that MSCs are low immunogenic and able to exert immunomodulatory function by various approaches, such as suppression of the lymphocyte proliferation, reduction of the dentritic cell generation, maturation and function, down?regulation of the CTL formation and enhacement of regulatory T?cell proportion. In vivo experiments show that MSC infusion can prolong the survival time of allo?skin graft in baboon and ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Successful reports have been documented about clinical application of MSC in the management of graft?versus?host disease. In this review, the immunological characteristics and the immunomodulation functions in vitro and in vivo of MSC were summarized.
Key words mesenchymal stem cells; immunomodulation; graft?versus?host disease
J Exp Hematol 2007; 15(5):1117-1120
间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是具有自我更新和多向分化为骨、脂肪、软骨等中胚层细胞的一种成体干细胞。现在人们已可以从多种物种的成体的多种组织中分离出MSC，体外和体内实验均证明了MSC及其分化细胞可给予造血细胞结构和功能上的支持，具有造血调节作用。MSC成为了组织工程和骨髓移植细胞治疗的研究热点。近年来，MSC的免疫调节功能逐渐受到人们的重视。
MSC表面分子免疫特性与异基因识别
MSC细胞表面只表达中等量MHC?I类分子，但不表达MHC?Ⅱ类分子及共刺激分子，如CD80、CD86、CD40和CD40L等。但将MSC裂解后，用Western blot方法可检测到细胞内存在痕量的MHC?Ⅱ分子；经IFN?γ诱导1?2天后，MHC?Ⅱ分子由细胞内转移到细胞膜上。 Krampera等［1］应用不表达MHC?I和MHC?Ⅱ分子的MSC细胞系，而Potian等［2］应用表达MHC?I和MHC?Ⅱ分子的MSC，他们研究发现二者均未引起免疫反应并发挥了相似的免疫抑制作用。这些实验结果表明，MHC分子表达与否与MSC的免疫原性及免疫调节功能的发挥并没有直接的联系。MSC具有着低免疫原性，提示体外培养和体内输注MSC都不会引起T细胞的活化和增殖。MSC与胸腺上皮有部分相同的表面分子，如： VCAM?1、ICAM?2、LFA?3，能介导其与T细胞间的相互作用，这可能是MSC免疫调控作用的分子学基础。
MSC在体外实验中抑制T淋巴细胞的增殖
越来越多的资料表明，MSC在体外实验的混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）、丝裂原刺激的淋巴母细胞转化实验(lymphocyte transformation test, LTT)以及CD3或CD28抗体刺激的淋巴细胞反应体系中均能抑制淋巴细胞的增殖，其中CD3+、CD4+、CD8+T细胞的增殖均被抑制。这种抑制作用有剂量依赖性，在MSC加入体系中一开始就表现出最大的抑制效果，晚些加入相同剂量的MSC只能保留部分抑制效果，呈时间依赖性。在用Transwell将人MSC与体系分隔培养时，MSC仍可发挥免疫抑制效应，说明MSC的这种免疫抑制作用可能是由于可溶性因子介导的［3，4］。与之相矛盾的是，另有应用MSC的培养上清液或transwell培养的实验中并没有观察到抑制效果［1］。 Rasmusson等［5］发现，MSC可能是通过不同机制来抑制丝裂原和异体细胞刺激的淋巴细胞增殖的。在MLR中，应用ELISA方法检测上清液，发现MSC提高了体系中IL?2和可溶性IL?2R的量，而在LTT体系中均有降低；在MLR体系中加入10% MSC则可提高IL?10的分泌，而在LTT体系中却无此效应；在MLR体系中加入消炎痛，一种前列腺素合成抑制剂，能部分降低MSC对淋巴细胞增殖的抑制作用，而在LTT体系中没有观察到此效果。Sun等［6］实验表明，同种、异种或第三者小鼠MSC都能够抑制异体T细胞刺激的淋巴细胞的增殖，并且有相同报道，第三者MSC比自体MSC具有更强的抑制效果［7］。Djouad 等［8］也证实，在人MLR体系中，人源性和鼠源性MSC均能抑制淋巴细胞的增殖，此结果说明这种抑制作用并没有种属特异性。
CD4+CD25+的细胞在自体免疫调节方面起着重要作用，因此人们将此群细胞定义为调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）。 Treg在人外周血中占CD4+细胞的5%-10%左右。据报道，在MLR体系中加入第三者MSC,能显著提高CD4+CD25bright 、CD4+CTLA?4+和CD4+CD25+CTLA?4+调节性T细胞的比例, 而加入自体MSC效果不明显［7］。在IL?2刺激的PBMNC增殖的体系中，MSC亦能提高CD4+CD25+ Treg细胞的比例［9］。但如果将CD4+细胞中CD25+细胞去除后再用异种单个核细胞加以刺激， 则MSC的共培养对Treg细胞的比例不产生任何影响，此结果意味着MSC可能是在免疫反应中提高Treg细胞的扩增潜能，而不是通过促进幼稚CD4+ T细胞分化为Treg细胞而发挥免疫调控作用的［10］。
MSC与抗原呈递细胞
外源性抗原可在局部或通过淋巴液和血液转运至淋巴组织，被该部位抗原呈递细胞（antigen presenting cells, APCs）摄取、加工、处理，以抗原肽?MHC?Ⅱ类分子复合物的形式表达于APC表面，供特异性CD4+Th细胞识别。APC识别和呈递抗原给T淋巴细胞是体内免疫反应的第一步，因此人们在研究MSC的免疫调节功能时也非常关心MSC对APC有何影响。树突状细胞（dentritic cells, DC）是激活初始T细胞最重要的APC。Jiang等［8］证明，MSC抑制了CD14+单核细胞向DC的分化； MSC在DC成熟的过程中下调了APC相关分子，如CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86和HLA?DR的表达，体系中如去除MSC并加入DC的诱导剂后可逆反这种抑制作用，这说明此作用是可逆的；与MSC共培养后的DC与单纯DC相比，其刺激CD4+增殖的能力有所减弱，炎性因子如IFN?γ、IL?12、TNF?α分泌减少，炎性抑制因子如IL?10分泌增加。最近，Nauta等［11］报道了MSC不仅对单核细胞来源DC，并且对CD34+细胞来源DC的分化和功能也有抑制作用。虽然在MSC抑制CD3和CD28抗体刺激的T细胞的增殖的体系中无APC的存在，但此研究结果提示， MSC抑制DC的发育与成熟是其免疫调节功能的机制之一。
MSC与细胞介导的细胞毒效应
对移植后清除异体细胞和感染时清除感染细胞，NK细胞和细胞毒性的杀伤性T细胞(CTL)是发挥细胞毒效应的重要靶细胞。人们对MSC与细胞毒作用的关系进行了大量的研究。Rasmusson等［13］发现，如果一开始就在第6天的MLR体系中加入MSC，其CTL介导的细胞溶解效应将降低70%，然而在第3天加入MSC，因为CTL已形成，则对细胞溶解效应没有任何影响。当把MSC和淋巴细胞用Transwell分离培养，MSC仍具有抑制CTL形成的作用，说明MSC是通过可溶性分子的分泌发挥此作用的。但是，MSC并没有减弱NK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤作用，MSC本身也不能引起淋巴细胞增殖和被CTL或NK所溶解。这些结果可能意味着在造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）后，MSC输注可能将降低CTL形成以减轻移植物抗宿主病（graft?versus?host disease, GVHD)的发生；另一方面，MSC输注不影响NK细胞对残余肿瘤细胞的杀伤，可以将GVHD和移植物抗肿瘤（graft?versus?leukemia, GVL）效应分开，发挥双重有利作用。Potian等［2］也报道了相似的结果。他们在MLR中用同一供者的PBMNC和（或）MSC来刺激异体PBMNC以诱导产生CTL。结果PBMNC刺激产生了大量的CTL，当体系中加入一定剂量的MSC， MSC可减少CTL的形成，抑制针对于异基因反应的细胞毒性作用，并呈剂量依赖性，而MSC本身并不会诱导产生CTL以溶解靶细胞。在对淋巴细胞亚型增殖情况的分析发现，由于MSC提高了CD4+淋巴细胞的扩增比例，CTL和NK细胞就相对变少。此实验说明，通过改变细胞比例可能是MSC发挥抑制细胞毒效应的机制之一［14］。有相似实验证明，MSC能抑制IL?2刺激的NK细胞IFN?γ分泌，而MSC本身不引起NK细胞的IFN?γ分泌［9］。
MSC体内免疫抑制作用
MSC的这些免疫学特性激起了众多家的研究热情，人们在对MSC体外的免疫调控作用进行大量细致研究的同时，对MSC体内是否也具有此作用，是否能在今后的疾病治疗中服务人类进行了积极探索。2002年Bartholomew等［15］发现，静脉输注狒狒骨髓来源的MSC能延长狒狒异体皮肤移植存活时间： 11.3±0.3 vs 7±0天。Guo等［16］也证明小鼠骨实质MSC的输注能延长小鼠异体皮肤移植存活时间。其病理结果表明炎性细胞的侵润和坏死明显减轻。2003年Djouad等［7］从两方面证实了MSC的体内免疫作用。他们将异基因MSC输入具有免疫活性的小鼠体内，发现MSC能够植入并形成新生异基因骨，虽然骨组织没被排斥，但在其周围发现了淋巴细胞侵润。此结果说明虽然小鼠MSC在体内具有免疫调控作用，但仍具有一定的免疫原性。小鼠的实验性自体免疫性脑脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelits, EAE）是反映人的多发性硬化的小鼠疾病模型。实验发现，在EAE发生之前或炎症高峰期静脉输注小鼠MSC，可减轻EAE症状，其病理检查显示MSC输注减轻了中枢神经系统炎性细胞侵润和脱髓鞘现象。然而在疾病稳定后，MSC输注却没有任何治疗效果。通过绿色荧光蛋白转染以示踪MSC体内分布，可在淋巴器官发现MSC的存在［17］。机体免疫抑制状态固然是对许多疾病的治疗起到至关重要的作用，但对肿瘤的杀灭和复发就是一个不利方面。Djouad等［7］发现，MSC在体外实验中具有抑制CTL形成的作用，但并没有减弱NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。关于MSC的免疫调控作用和肿瘤生长的关系他们作了以下体内实验：把黑色素瘤细胞皮下注入具有免疫能力的小鼠，然后将MSC静脉输注或皮下输注在肿瘤细胞的周围，结果MSC促进了肿瘤细胞的生长，而单纯MSC输注和肿瘤细胞的移植并不能在具有免疫能力的这种小鼠体内形成肿块［7］。所以在利用MSC的免疫调节功能有利的一面时，还必须同时考察此功能的有弊一面，应从整体水平考虑MSC移植后在体内所发挥的功能。
MSC与GVHD
20世纪90年代以来，造血干细胞移植技术飞速进展，更为安全有效，已成为治愈多种良性、恶性血液病与遗传性疾病的重要手段，治愈的病种还在不断的扩大。据统计，目前我国等待造血干细胞移植的患者有几百万，仅白血病患者1年就新增4万人以上，其中半数以上是儿童，因白血病死亡的人数已超过3.6万。能寻找到与配型相合的骨髓，并进行造血干细胞移植，是目前能够使他们生存的一种很有效方法。HLA?I类抗原和HLA?Ⅱ类抗原的成分皆随人而异，具有极大的个体差异性，同胞兄弟姐妹中仅有1/4的机会完全相同，无血缘关系的人群中HLA完全相同的机会极少，约几万至几十万分之一。GVHD是HSCT后长期存在的最棘手问题,在双胞胎HSCT中GVHD发生率为1%-5%，亲属中为36%，非血缘关系为50%-70%。产生GVHD的免疫应答是一个涉及供者T细胞和NK细胞与受者特异细胞相互作用的复杂过程,是由细胞因子和淋巴细胞?靶细胞相互作用共同介导的,并可导致多脏器损伤。目前，人们对预防和治疗GVHD进行着不断的探索。因为MSC可以通过抑制DC的诱导产生、延迟DC的成熟、降低T细胞的增殖、减少了CTL的形成等多种机制发挥免疫调控作用，因此，MSC输注可能是预防和治疗GVHD的一种细胞治疗途径。最早在1995年，Lazarus等［18］对MSC输注以抑制GVHD的效果进行了体内研究。他们在对1例23岁处于完全缓解期的血液系统肿瘤患者的自体骨髓MSC进行了分离扩增，采取了在HSCT时合并MSC的共输注的治疗方案，此方案很好地促进HSC植入并有效地抑制了GVHD的发生。2005年Lazarus等［19］又将46例血液系统肿瘤患者进行了HLA相合的异体MSC和HSC共移植的治疗，在HSC移植前4小时静脉输注MSC，结果没有发现针对异体MSC的排斥反应、异位组织的形成和GVHD发生的提高等不良反应。2002年Lee等［20］的1个病例报道也证实了这一结果。1例20岁的急性髓系白血病的患者，接受了其父亲的相合的HSC和MSC的共移植，经过31个月的病情追踪，惊喜地发现此患者得到了快速的植入，而没有急性GVHD的发生。2004年，Le Blanc等［21］报道了1个9岁淋巴母细胞瘤白血病男孩接受了HLA3/6相合的女性HSCT治疗，术后发生了Ⅳ级GVHD，分别在第73天和第170天进行了其母亲的MSC输注，此患者奇迹般地迅速好转并在第220天治愈出院。这些研究均说明了MSC输注可安全有效地促进HSC植入和预防GVHD。美国国家卫生部已将应用MSC治疗GVHD纳入了临床治疗阶段，但MSC在体内发挥作用的具体机制还有待于进一步的研究。
结 语
MSC具有低免疫原性和免疫调节作用，使其成为研究领域的热点之一。现在人们已可以从多种物种的多种成体组织中分离出MSC, 来源广泛，且异体MSC比自体MSC更易获得，所以MSC这种低免疫原性和第三者MSC具有更强的免疫抑制作用使MSC的异基因移植具有更广阔的应用前景。希望通过对MSC免疫调控的系统研究，使MSC能够作为一种通用型的细胞制剂，为人类的疾病提供更多更好的治疗策略和处理方案。
【】
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