TGF

              作者：王金堂，李军，贾光辉，张小卫，张银刚

【关键词】  TGF

　　摘要：目的  探讨应用TGFβ1多克隆抗体抑制术后屈指肌腱黏连的效果。方法  将108只来亨鸡随机分成3组，行中趾屈指肌腱切断吻合术，术中分别滴加生理盐水或不同浓度的TGFβ1多克隆抗体，于术后1、3、8周取肌腱行HE染色、Masson胶原染色、苦味酸天狼星红染色和TGFβ1免疫组化染色。结果  TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组炎症过程缩短，塑形过程加速；TGFβ1多克隆抗体5μg/mL组、10μg/mL组Ⅰ胶原含量减少，且Ⅰ/Ⅲ胶原比例下降，TGFβ1的表达降低。结论  TGFβ1多克隆抗体可以有效地抑制TGFβ1在肌腱损伤修复过程中的作用，减少肌腱的黏连、瘢痕组织的形成，这可能是屈指肌腱损伤术后黏连潜在的有效方法之一。

　　关键词：TGFβ1抗体；肌腱；黏连；显微外科手术

　　The preventive effect of TGFβ1 neutralizing antibody　on flexor tendon adhesion from operation

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the preventive effect of TGFβ1 neutralizing antibody on flexor tendon adhesion from operation. Methods  Totally 108 leghon cocks performed anastomosis operation were divided into three groups randomly: normal saline (control group), 5μg/mL group, and 10μg/mL group of TGFβ1 antibody. At week 1, 3, and 8, respectively, after operation, HE staining, Masson staining, Sirius redpolarization staining and TGFβ1 immunohistochemistry staining were used. Results  Compared with the control group, the 10μg/mL group had less shortened progress of inflammation and accelerated progress of molding; in the experimental groups (5μg/mL group, 10μg/mL), the density of the collagen Ⅰ type was smaller, the ratio of Ⅰ/Ⅲ collagen and expression of TGFβ1 decreased. Conclusion  TGFβ1 multiclonal neutralizing antibody can effectively inhibit the function of TGFβ1 during the flexor tendon repair, reduce tendon adhesion and scar formation, suggesting that it is a latent and effective method for preventing flexor tendon from adhering after operation.

　　KEY WORDS: TGFβ1 antibody; tendon; adhesion; microsurgery

　　屈指肌腱损伤是一种较为常见的损伤，由于肌腱损伤修复后会出现黏连[1]，使得肌腱功能的恢复一直不理想。因此，如何减轻或者预防黏连的发生，是手外科迫切需要解决的问题[2]。近年来的研究表明，转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGFβ1)在促纤维化方面发挥主要作用[3]。很多研究用阻断TGFβ1作用的方法抑制肝炎、肾炎后脏器纤维化的形成，并在动物模型中取得了成功[4]，但应用于肌腱术后黏连，尚未见相关报道。因此，本实验将采用来亨鸡模型，研究TGFβ1多克隆抗体治疗屈指肌腱术后黏连的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物  雄性成熟来享鸡54只，体重2.5-3.0kg，随机分为3组：生理盐水对照组(NS)、TGFβ1多克隆抗体5μg/mL组及10μg/mL组。

　　1.2  主要试剂和检测仪器  TGFβ1多克隆抗体购自宝泰克生物工程公司，多功能测试仪购自华龙有限公司。

　　1.3  手术方法  氯胺酮肌注麻醉(25mg/kg)，常规剃毛消毒，在左侧跖趾趾中节掌面行“L”切口，掀起皮瓣分离皮下组织，暴露趾纤维鞘，用90丝线褥式缝于纤维鞘上，在两缝线之间切开纤维鞘。于趾浅屈肌腱分叉下方将趾深屈肌腱横断，用90丝线行改良Kessler法缝合。将纤维鞘上的丝线打结，关闭纤维鞘，鞘内注射TGFβ1多克隆抗体或生理盐水。术后石膏固定跖趾及趾间关节于屈曲位。术后3d每天肌注青霉素80万单位，石膏固定7d后去除石膏，伤口换药，伤口愈合良好，被动活动足趾。于术后1、3、8周时间点每组随机取6只鸡，行组织学检测。

　　1.4  组织HE染色  将取得的肌腱组织用Bouin氏液固定2h；自来水冲洗4-6次，放入蒸馏水中浸泡2h；将肌腱组织于40-50℃的Mayer染液中染色18-24h；再用40℃的蒸馏水浸泡18h，自来水冲洗6-8h；将肌腱组织经体积分数为70%、80%、90%乙醇脱水至体积分数为95%乙醇，用复制伊红乙醇液于40-50℃染色12h；再经体积分数95%无水乙醇脱水、二甲苯透明后浸蜡3h包埋成蜡块，切成5μm薄片，经展片、烤片、二甲苯脱蜡，封片观察。

　　1.5  Masson染色  常规脱蜡至水，置Bouin液室温过夜或56℃ 1h，流水冲洗至黄色消失，蒸馏水洗；Weigert铁苏木精染核10min，盐酸乙醇分色，流水冲洗10min，蒸馏水洗；Ⅰ液(1%比布列西猩红水溶液90mL，1%酸性品红水溶液10mL，冰乙酸1mL)染2min，蒸馏水洗；Ⅱ液(磷钼酸2.5g，磷钨酸2.5g，蒸馏水100mL)染15min；Ⅲ液(苯胺蓝 2.5g，冰乙酸2mL，蒸馏水100mL)染5min，常规脱水透明，中性树胶封片观察。

　　1.6  偏振光显微镜观测  石蜡切片经常规脱蜡至水，置于1g/L苦味酸天狼星红染液中1h；自来水流水冲洗5min； 常规Harris苏木精复染，逐级脱水，二甲苯透明、树胶封片，偏振光显微镜下读片，用自带的图像分析软件进行分析。

　　1.7  TGFβ1 免疫组化染色  SABC法检测TGFβ1。切片脱蜡至水，依次经3%(体积分数)双氧水室温10min，复合消化液室温5-10min，山羊血清封闭液室温10min，兔抗TGFβ1抗体37℃下孵育30-60min，生物素化山羊抗兔IgG 20-37℃孵育20min，SABC试剂20-37℃ 20min，DAB显色，Ehilich酸性苏木素复染4-5min，脱水、透明、封片，光镜检查。应用北航医学半自动彩色图像分析系统进行灰度扫描。

　　1.8  统计学分析  所有数据用均数±标准差(±s)表示，统计学分析采用两因素方差分析模型(时间×组别)进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  大体观察结果  所有动物都耐受了手术，术后无感染、死亡及其他并发症。对照组动物术后3周，可见腱鞘周围形成致密的黏连带，肌腱活动差，愈合良好；术后4周黏连稍松解；术后8周黏连疏松，面积减小。TGFβ1多克隆抗体5μg/mL组、10μg/mL组大体观察与对照组没有明显变化。

　　2.2  形态学变化  在肌健修复过程中，与对照组比较，TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组炎症过程缩短，塑形过程加速。术后1周，TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组肌腱吻合口处可见炎性细胞和少许红细胞，断端间成纤维细胞及胶原纤维填充其间，周围组织中成纤维细胞及胶原纤维少见，肉芽组织(即新生血管、炎细胞、成纤维细胞)少见，并且胶原纤维及成纤维细胞方向较一致。而对照组及TGFβ1多克隆抗体5μg /mL组周围组织中成纤维细胞及胶原纤维较多，肉芽组织较多，并且胶原纤维及成纤维细胞方向紊乱。术后3周，TGFβ1多克隆抗体10μg /mL组肌腱吻合口处的炎细胞明显减少，红细胞大多被吸收，胶原纤维及成纤维细胞增多，排列趋向规则，与肌腱长轴接近平行。而对照组肌腱吻合口处仍有部分炎细胞，断端间为肉芽组织填充包绕，与周围组织界限不清，胶原纤维较前有所增多，但排列仍然紊乱，不规则。术后8周，TGFβ1多克隆抗体10μg /mL组肌腱吻合口处的胶原纤维趋于成熟，成纤维细胞排列更为规则，并基本完成了塑形，肌腱周围瘢痕组织较少，结构疏松。对照组肌腱吻合口处仍可见少许炎细胞，周围胶原纤维增生致密，排列仍欠规则。

　　2.3  胶原评估  Masson染色显示，术后1周时，对照组肌腱周围胶原纤维出现，排列紊乱，肌腱内外有大量巨大细胞核的成纤维母细胞形成，微血管生长快。TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组肌腱周围胶原纤维含量少，肌腱内外成纤维母细胞均较少。术后3周时，对照组肌腱周围胶原纤维较多且致密，成纤维母细胞的比例较多。TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组周围胶原纤维较少且疏松，胶原纤维基本成熟，排列较一致。术后8周时，对照组吻合口周围胶原纤维排列混乱，腱周大量胶原形成，与肌腱连接紧密，而TGFβ1多克隆抗体组肌腱周围胶原纤维较少。苦味酸天狼星红染色偏振光显微镜下观察显示，术后1周，TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组肌腱周围Ⅰ型胶原的比例较对照组低，而对照组Ⅰ型胶原的含量明显增加，胶原结构混乱。术后3周时，TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组肌腱周围的组织中Ⅲ型胶原的含量较高，Ⅰ型胶原的含量较少，而对照组肌腱周围的Ⅰ型胶原的含量较多，Ⅲ型胶原的含量较少(图1)。术后8周时，TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组与对照组染色都可见Ⅰ型胶原，但前者胶原排列紊乱(表1、图1)。

　　表1  实验各组苦味酸天狼星红染色Ⅰ型胶原的定量分析（略）

　　Table 1  The density of collagen Ⅰ type by Sirius redpolarization staining

　　*P<0.05 vs. NS group

　　图1  术后3周肌腱偏振光显微镜的观察结果（略）

　　Fig.1 At the 3rd week, compared with control group (A), there were more type Ⅲ  collagens and fewer type Ⅰ collagens in 10μg/mL TGFβ1  antibody group (B)

　　2.4  TGFβ1的表达  在肌健修复过程中，与对照组比较，TGFβ1多克隆抗体组TGFβ1的表达降低(表2)。术后1周时，对照组肌腱吻合口周围可见腱膜细胞中呈链状排列的TGFβ1，肌腱TGFβ1含量虽略降低，但仍维持较高水平，阳性颗粒密集。TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组肌腱吻合口周围腱膜细胞中阳性颗粒明显减少，周围组织内TGFβ1含量明显降低(图2)。术后3周和8周时，TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组与对照组仍能检测到TGFβ1散在于组织内，但两组没有显著性差异。
　　
　　表2  实验各组TGFβ1的表达定量分析（略）

　　Table 2  The expression of TGFβ1 in the groups

　　*P<0.05 vs. NS group

　　图2  术后1周肌腱吻合周围TGFβ1表达（略）

　　Fig.2 At the 1st week, compared with the value in control group(A), there was less expression of TGFβ1 in 10μg/mL group (B)

　　3  讨论

　　本实验结果显示，在肌健修复过程中，TGFβ1多克隆抗体10μg/mL组炎症过程缩短，塑形过程加速；TGFβ1多克隆抗体5μg/mL组、10μg/mL组胶原含量减少，且Ⅰ/Ⅲ胶原比例下降， TGFβ1表达降低。为了能精确评估TGFβ1中和抗体对肌腱术后黏连的作用，我们采用TGFβ1免疫组化染色观察中和抗体对TGFβ1表达的影响，Masson染色、 偏振光显微镜观测修复过程中的胶原比例的变化，以探讨其作用机制。免疫组化观察结果显示，在术后1周时，生理盐水对照组肌腱吻合口周围可见TGFβ1阳性颗粒呈链状排列的腱膜细胞，肌腱细胞中有TGFβ1阳性颗粒聚集，但含量较腱膜细胞中低。虽TGFβ1 阳性颗粒略降低，但仍维持较高水平。TGFβ1抗体组肌腱吻合周围腱膜细胞中TGFβ1阳性颗粒明显减少，周围组织内TGFβ1阳性颗粒较对照组明显减少。术后3周和8周时，TGFβ1抗体组与对照组仍能检测到TGFβ1阳性颗粒散在于组织内，但没有显著性差异。说明肌腱组织在创伤的早期TGFβ1分泌明显升高，随着时间的延长逐渐下降，早期应用TGFβ1中和抗体可有效地抑制其分泌和阻断其活性。在本实验中，胶原检测显示，在肌腱修复过程中，TGFβ1抗体组胶原含量减少，且Ⅰ/Ⅲ胶原比例下降，而这正是产生黏连及瘢痕化的病基础[5]。研究认为，TGFβ1作用于转录起始部位上游的一个顺时作用元件来上调Ⅰ型胶原基因的表达，从而加速Ⅰ型胶原的胞外沉积[6]，过度胶原沉积使瘢痕形成。TGFβ1抗体中和TGFβ1，降低了成纤维细胞合成大量Ⅰ型胶原纤维，从而减少了肌腱与周围组织黏连。

　　也有研究显示TGFβ1抗体可以抑制实验组织中的Ⅰ型胶原蛋白的表达，但对Ⅲ型胶原蛋白的表达却没有影响[7]。肌腱周围瘢痕组织中Ⅰ型胶原比例增加，瘢痕组织的硬度明显加强。应用TGFβ1抗体后Ⅰ型胶原比例减小，瘢痕舒展度加强，对于日后的软化有较好的疗效。本实验中，TGFβ1抗体5μg/mL、10μg/mL组并没有明显差异，因此仍需要对剂量效应关系进一步探讨。而且，在临床应用之前，仍有许多关键问题需要解决，如抗原性、个体对抗体反应的差异性，局部给药途径和时间的控制等。总之，TGFβ1多克隆中和抗体可以有效地抑制TGFβ1在肌腱损伤修复过程中的作用，减少肌腱的黏连、瘢痕组织的形成，而不影响肌腱的强度，这可能是屈肌腱损伤术后黏连潜在的有效方法之一。

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　　[1]Strickland JW. The scientific basis for advances in flexor tendon surgery [J]. J Hand Ther, 2005 18(2):94110.

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　　[5]Klein MB, Yalamanchi N, Pham H, et al. Flexor tendon healing in vitro: effects of TGFbeta on tendon cell collagen production [J]. J Hand Surg, 2002,27(2):615620.

　　[6]Ritzenthaler JD, Goldstein RH, Fine A, et al. Transforminggrowthfactorbeta activation elements in the distal promoter regions of the rat alpha 1 type I collagen gene [J]. Biochem J, 1991,15(1):157162.

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