Humanin的基因克隆及序列测定
作者：靳辉，王唯析，杨广笑，王全颖，胡海涛，韩太真
【关键词】 阿尔茨海默病
作者简介：靳辉(1973)，女(汉族),解剖学硕士. 研究方向：阿尔茨海默病的病理机制及防治.
摘要：目的 利用基因工程方法对Humanin进行基因克隆并测定其序列，为进一步对阿尔茨海默病进行基因奠定基础。方法 采用非对称互补引物/模板法，制备两端含有酶切位点的Humanin的cDNA，将其克隆入pVAXI载体中并测序。结果 经酶切鉴定、测序分析，表明所插入的基因片断为Humanin基因，与设计完全相同。结论 成功地克隆了Humanin基因。
关键词：阿尔茨海默病；Humanin；基因克隆；序列测定
ABSTRACT: Objective To use gene engineering technique to clone and sequence theHumanin. Methods By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of Humanin was constructed, which had restriction enzymes sites on the two extremes. Then the cDNA was subcloned into the plasmid pVAXI and sequenced. Results Evidences of DNA sequence analysis and restriction enzymes digestion showed that the inserted fragment wasHumanin cDNA, consistent with the fragment we designed. Conclusion The Humanin cDNA was cloned successfully.
KEY WORDS: Alzheimer's disease; Humanin; gene cloning; sequencing
阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是以进行性的记忆减退、认知障碍和痴呆为临床表现的老年人常见疾病，发病率随着人口的老龄化而迅速增加，已成为继心血管疾病、癌症和中风之后的又一严重危害人类健康的疾病。目前世界各国均在积极寻找防治AD的有效措施。近年，日本学者首先从AD患者未发病的大脑枕叶分离出一种称为Humanin(HN)的短肽。它能有效抑制AD相关基因：淀粉样蛋白前体(amyloid precursor, APP)基因、早老素1(presenilin1, PS1)基因、早老素2(presenilin2, PS2)基因的突变，以及β淀粉样肽(amyloid peptide, Aβ)引起的神经细胞死亡，且Humanin的一种衍生物――Humanin(HNG)，被证实作用较HN强1000倍。迄今，Humanin及其衍生物的作用机制仍不十分清楚。为了深入研究其对AD的作用机制以及为开发新的更为有效的抗AD药物提供，我们首次在国内对HNG进行基因克隆。
1 材料与方法
1.1 材料 大肠杆菌E.coli DH5α、质粒载体pVAXI 由西安华广生物工程公司提供。限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ、SalⅠ及T4 DNA连接酶，均购自华美生物工程公司。
1.2 HNG DNA 的设计与合成 根据Hashimoto等人提供的HN基因序列，将其第14位丝氨酸碱基AGT换为甘氨酸碱基GGG，形成HNG基因序列，在其前后分别加入质粒载体pVAXI多克隆位点上的两个单一酶切位点KpnⅠ和XhoⅠ，并在HNG基因编码区的下游引入了一个载体上没有的酶切位点SalⅠ。设计HNG非全长、部分互补的两条单链DNA，使其互为引物、互为模板制备全长HNG cDNA。序列如下：正链：CGGTACCATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCGGGGAAATTG；负链：GCCTCGAGCGTCGACTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCCCCGG(正链中GGTACC为KpnⅠ酶切位点，GGG为第14位甘氨酸的编码碱基；负链中CTCGAG、GTCGAC分别为XhoⅠ、SalⅠ酶切位点；下划线部分为12个互补碱基)。以上序列均由上海生物工程有限公司合成，PAGE纯化。
1.3 重组质粒的构建 将上述正负链退火后再以Klenow酶补平使之成为完整的双链DNA，载体pVAXI及补平的HNG基因分别用KpnⅠ和XhoⅠ酶切，T4 DNA连接酶16℃水浴16h后，常规方法转化大肠杆菌DH5α，并将转化菌在加有卡那霉素的琼脂平板上进行培养，随机挑取单菌落扩增、提取质粒并酶切，将酶切初步筛选的阳性重组质粒进行基因序列测定。
1.4 序列测定 DNA序列测定由上海生物工程有限公司在3900型DNA自动分析仪上完成，以载体上的T7引物进行单向测序反应。
2 结 果
2.1 重组质粒的构建 克隆构建的重组质粒命名为pVAXI/HNG，其构建策略如图1。
图1 重组质粒pVAXI/HNG构建示意图（略）
2.2 重组质粒酶切鉴定结果 重组质粒大小为3016bp，对pVAXI/HNG的初步鉴定是用质粒载体多克隆位点上的两个单一酶切位点KpnⅠ和XhoⅠ酶切，12份质粒中，6份被切成大小两个可见片段，其中小片段位于100bp marker前方，大片段位于λDNA/HindⅢ marker 2322bp与4361bp之间(图2C)，此两片断与理论值81bp及2935bp相符。此6份质粒用SalⅠ消化，可见质粒被线性化，只有一条条带(图2D)，位置与未经酶切的重组质粒(图2E)相近(图2)。图2 pVAXI/HNG重组质粒酶切鉴定图谱（略）
2.3 测序结果 采用电脑DNA分析辅助软件，将上海生物工程有限公司测定的基因序列进行分析，结果发现该序列与设计完全相同。
3 讨 论
HN是一种新近发现的神经保护肽，含24个氨基酸残基(MetAlaProArgGlyPheSerCysLeuLeuLeuLeuThrSerGluIleAspLeuProValLysArgArgAla)，其基因序列首先由日本研究者Hashimoto等人从尸检诊断为AD病病人未发病的枕叶cDNA文库中筛查得出，其mRNA与线粒体16s rRNA基因组有99.9% 的同源性。HN能有效抑制AD相关基因及Aβ所引起的细胞毒作用，其衍生物HNG作用较HN强1000倍。Hashimoto指出HN的一级结构具有信号肽结构特点，可被分泌至细胞外，转染HN cDNA的F11细胞培养介质，使其具有细胞保护活性，可明显抑制V642IAPP引起的 F11细胞的死亡。细胞外的HN通过与细胞表面受体结合，继而激活细胞内信号传导通路而发挥其细胞保护作用 。培养介质中加入HN (HNG)肽，可抑制Aβ肽的细胞毒性，也可通过提高细胞的代谢活性，增加ATP产量来抑制去血清引起的PC12细胞及人淋巴细胞的凋亡。此外，有关动物实验表明，脑内注射HNG肽可以改善东莨菪碱引起的动物学习记忆障碍。然而，已有的关于HNG的研究都是使用合成肽直接进行的，而HNG是在HN一级结构改变的基础上形成的衍生物, 那么HNG自身是否具有分泌活性，以及通过基因工程方法得到的HNG肽是否具有细胞保护作用还不清楚。因而，我们拟通过定点突变，首先克隆获得HN衍生物HNG 基因，并在后续的实验中检验HNG是否能够分泌表达，以及表达的HNG肽是否具有细胞保护作用，以期为AD的基因提供实验基础。
基因的获得一般有两种方法：一是直接从基因文库中获得(如PCR法等)。该法多用于未知基因的筛选或大的基因片段的获得；另一种为通过人工合成而获得，对此有两种方法可供选择，一是合成全长正、负链后直接退火使之成为完整的双链，另一种是合成非全长、部分互补的两条单链DNA,退火后再以DNA聚合酶补平使之成为完整的双链。HNG为 24个氨基酸组成的短肽。我们采用人工合成的后一种方法获得HNG基因，其优点除费用低外，主要考虑到可缩短合成链的长度，这样合成较容易，正确性高。
合成HNG DNA 时，除在其前、后分别加入质粒载体多克隆位点上的两个单一酶切位点KpnI和XhoⅠ外，在HNG基因编码区的下游还特意引入了一个载体上没有的单一酶切位点SalⅠ，主要考虑重组质粒经酶切后分离出的插入片段(81bp)与质粒上切下的小片段(64bp)大小相似，在琼脂糖凝胶上不易区分，重组子初步筛选较为困难。而引入SalⅠ后，理论上，只有重组质粒才能被SalⅠ线性化，同时也可被质粒载体多克隆位点上的两个单一酶切位点KpnⅠ和XhoⅠ酶切成81bp和2935bp两个片段。
在本研究中，重组质粒既被HindⅢ和XhoⅠ酶切成大、小两个片段，又被SalⅠ线性化；且经以上方法初筛出的重组子经DNA测序分析，序列与设计完全相同。因此，我们成功克隆了神经保护肽HNG基因。
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