急性白血病多药耐药蛋白的异常表达及其与临床疗效和预后的关系
【摘要】 目的 研究多药耐药蛋白P?糖蛋白(PGP)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、谷胱甘肽?硫?转移酶π(GST?π)和拓扑异构酶Ⅱα(TOPOⅡα)在初发急性白血病(AL)患者中的表达，并探讨其与疗效及预后之间的关系。方法 采用免疫组化SABC法检测了PGP、MRP1、GST?π、TOPOⅡα在30例AL患者白血病细胞中的表达情况。结果 PGP、MRP1、GST?π、TOPOⅡα在初发AL中表达的阳性率分别为23.33%、36.6%、60%和43.33%；PGP 、MRP1阳性组的完全缓解(CR)率均明显低于阴性组(P<0.01)；TOPOⅡα阳性组的CR率为92.31%，高于阴性组的58.82%(P<0.05)；GST?π阳性组的CR率与阴性组的CR率之间无统计学意义(P>0.05)。结论 单一PGP、MRP1的表达升高及TOPOⅡα的表达降低与AL的反应差、预后不良有明显的相关性；联合多个多药耐药蛋白能够更准确地预测AL的耐药和预后。
【关键词】 急性白血病；多药耐药；疗效；预后
Relationship between ectopic expression of multidrug resistance?related proteins and clinical efficacy and prognosis in acute leukemia
ABSTRACT: Objective To study the expression of multidrug resistance?related protein PGP, MRP1, GST?π and TOPOⅡα in de novo acute leukemia(AL) and explore the relationship between its expression and chemotherapy efficacy and prognosis. Methods The expression of PGP, MRP1, GST?π and TOPOⅡα was detected by SABC method of immunohistochemistry in leukemia cells of 30 de novo patients. Results The positive rate of PGP, MRP1, GST?π and TOPOⅡα was 23.33%, 36.6%, 60% and 43.33% in de novo AL, respectively. The complete remission (CR) rate in PGP or MRP1 positive group was obviously lower than that in PGP or MRP1 negative group(P<0.01). The CR rate of TOPOⅡα positive group (92.31% ) is higher than TOPOⅡα negative group (58.82%, P<0.05). There was no significant difference between GST?π positive group and GST?π negative group (P>0.05). Conclusion Single overexpression of PGP and MRP1 or single decreased expression of TOPOⅡα is strongly related to poor chemotherapy efficacy and poor prognosis in AL. Combining more than one multidrug resistance?related proteins can predict the drug resistance and chemotherapy efficacy more accurately in AL.
KEY WORDS: acute Leukemia (AL); multidrug resistance (MDR); chemotherapy efficacy; prognosis
多药耐药(multidrug resistance, MDR)是导致白血病化疗失败的最主要的原因之一，也是彻底治愈白血病的最大障碍。近年来研究发现，白血病细胞膜转运蛋白P?糖蛋白(P?glycoprotein, PGP)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance?associated protein 1, MRP1)、细胞浆内谷胱甘肽?硫?转移酶π(glutathione?S?transferase?π, GST?π)、细胞核内拓扑异构酶Ⅱα(topoisomeraseⅡα, TOPOⅡα)的表达异常以及抗凋亡因子Bcl?2、survivin等的表达增高均与多药耐药有关[1?2]。在本研究中，我们采用免疫组化SABC法检测了30例初发急性白血病(acute leukemia, AL)患者骨髓白血病细胞中PGP、MRP1、GST?π、TOPOⅡα的表达情况，探讨不同蛋白表达与初发AL的疗效、预后间的关系及其对化疗的指导作用。
1 材料与方法
1.1 临床资料 初发AL患者30例，男性16例，女性14例，中位数年龄37.5岁。全部病例均经FAB分型，部分病例结合免疫分型。其中，急性髓细胞性白血病(AML)26例，急性淋巴细胞性白血病(ALL)3例，急性混合细胞性白血病1例。初发AML患者采用DA、HA、MA(D：柔红霉素；H：高三尖杉酯碱；M：米托蒽醌；A：阿糖胞苷)为主的化疗方案；初发ALL患者采用VCDLP(长春新碱、环磷酰胺、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、泼尼松)为主的化疗方案。耐药评定是经 2个上述标准化疗方案治疗后骨髓未达完全缓解的病例。
1.2 方法
1.2.1 单个核细胞的制备 抽取骨髓3mL，置于肝素抗凝管中，加生理盐水2mL，缓慢注入含有5mL Ficoll淋巴细胞分离液的离心管上层，1800r/min离心20min，吸取单个核细胞，生理盐水洗涤2次后弃上清，40g/L多聚甲醛悬液固定30min后，配成细胞悬液制作成滴片。
1.2.2 PGP、MRP1、GST?π、TOPOⅡα的检测 采用免疫组化SABC法。PGP采用鼠抗人单克隆抗体(MDRAb?2，CLONE F4，Neu Makers公司)，TOPOⅡα采用鼠抗人单克隆抗体(JH2.7，北京中山生物技术有限公司)，MRP1用兔抗人单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，GST?π采用兔抗人多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。免疫组化SABC试剂盒购自IMMUNOTECH公司，具体操作按说明书进行。
1.2.3 免疫组化阳性结果的判断[3] PGP阳性者细胞膜或细胞浆呈黄色或棕黄色；MRP1阳性者胞浆中散在黄色或棕黄色颗粒，胞膜呈黄色或棕黄色；GST?π阳性为细胞浆呈黄色或棕黄色，有散在黄色或棕黄色细小颗粒。PGP、MRP1、GST?π阳性细胞数≥10%为阳性。TOPOⅡ阳性者胞核呈黄色或棕黄色，阳性细胞数≥20%为阳性。
1.3 统计学处理 数据用SPSS11.0统计软件处理，采用确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 四种耐药蛋白的表达及其与疗效和预后的关系 PGP、MRP1、GST?π、TOPOⅡα在初发AL患者中表达的阳性率分别为23.33%、36.6%、60%和43.33%(图1)。PGP阳性患者的完全缓解(CR)率为28.57%(2/7)，明显高于PGP阴性患者的86.96%(20/23)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)；MRP1阳性患者的CR率为36.36%(4/11)，明显低于阴性患者的94.74%(18/19)，两组间差异有统计学意义(P<0.01)；GST?π阳性患者的CR率为61.11%(11/18)，阴性患者的CR率为91.67%(11/12)，两组间差异无统计学意义(P>0.05)；TOPOⅡα阳性患者的CR率为92.31%(12/13)，明显高于阴性患者的58.82%(10/17)，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。
图1 PGP、MRP1、GST?π、TOPOⅡα的免疫组化染色（略）
Fig.1 Immunohistochemistry stain result of PGP, MRP1, GST?π, TOPOⅡα ×1000
A, B: PGP, MRP1 positive, the memberane and cytosol of positive cells is stained with brown?yellow; C: GST?π positive, the cytosol of positive cells is stained with brown; D: TOPOⅡα negative, the nucleus of positive cells is stained with brown
2.2 四种中至少有两项表达异常与疗效及预后的关系 PGP、MRP1、GST?π和TOPOⅡα中至少有两项指标表达异常(PGP、MRP1、GST?π为表达阳性，TOPOⅡα为表达阴性)患者的CR率为38.46%(5/13)，而PGP、MRP、GST均表达阴性伴TOPOⅡα表达阳性患者共11例均达到CR。PGP、MRP1、GST?π和TOPOⅡα中至少有两项指标表达异常组的CR率明显低于均表达正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 PGP、MRP1、GST?π均表达阳性伴TOPOⅡα表达阴性与疗效及预后的关系 PGP、MRP、GST表达阳性伴TOPOⅡα表达阴性的患者有3例。其中，1例M1患者3个疗程达到CR，但3月内又复发，1年内死亡；1例M2患者从未达到CR，5月内死亡；1例M3从未达到CR，半年内死亡。这3例患者临床都对化疗不敏感，预后极差。而PGP、MRP、GST均表达阴性伴TOPOⅡα表达阳性患者共11例，均达到CR，预后良好。
3 讨论
多药耐药是指白血病细胞对结构和作用机理完全不同的多种化疗药物同时产生耐药性，是导致白血病化疗失败的主要原因。PGP是最早发现的与多药耐药有关的蛋白，是一种细胞膜表面转运蛋白，可将化疗药物主动转运至细胞外，使细胞内与靶点结合的药物浓度降低，不能起到有效地杀伤瘤细胞作用，从而产生耐药。大量研究发现，PGP表达阳性患者对诱导缓解化疗反应以及生存期都较PGP表达阴性患者的差[4?5]。并且PGP在难治性、复发性白血病患者中的表达明显高于初发组患者，说明PGP表达与白血病的预后不良有关。本研究也发现PGP表达阳性患者组的完全缓解率明显低于阴性患者组，显示PGP表达阳性患者对诱导缓解化疗反应差，表明PGP表达与初治白血病疗效之间确实存在着一定的相关性。因此，PGP可作为分析判断初治白血病疗效及预后的重要指标之一。MRP1是继PGP之后发现的又一与耐药相关的膜表面糖蛋白，耐药机理与PGP相似，通过降低细胞内药物积聚或改变药物在细胞内的分布产生耐药[6]。有研究发现MRP1基因表达升高及蛋白表达阳性患者的疗效和预后都较MRP1基因表达降低及蛋白表达阴性患者差，提示MRP1表达与白血病的疗效及预后有关[4,7]。本研究结果显示，MRP1阳性患者组的CR率为36.36%，明显低于 MRP1阴性患者组的94.74%，两组间差异有统计学意义。表明MRP1的表达的确与白血病的临床疗效存在一定的相关性，MRP1的表达与否也是预测白血病耐药和预后的重要指标之一。GST?π是人体内重要的解毒酶，能催化亲类化疗药物与还原型谷胱甘肽结合，形成一种硫醚连接的还原型谷胱甘肽结合物(GS?结合物)，使药物毒性减低，水溶性增加，利于排出，从而产生耐药。其耐药作用已在多种实体瘤中得到证实，但与白血病耐药中的关系仍待进一步阐明。有研究发现GST?π表达阳性白血病患者的临床疗效和预后差[8]，但也有研究显示GST?π表达阳性与白血病的疗效和预后无关[9]。本文通过对30例急性白血病患者的研究发现，尽管GST?π阳性患者组的CR率低于GST?π阴性患者组，但两者之间差异无统计学意义。表明GST?π的表达与白血病的疗效和预后无相关性，不能单独用于预测白血病的耐药和预后。TOPOⅡα是真核细胞内重要的核酸酶，具有DNA内切酶和连接酶功能，介导DNA双链的断裂与重接反应。TOPOⅡα也是许多白血病化疗药物作用的靶点，其表达降低就会使化疗药物作用的靶点减少，形成的可断裂复合物减少，以及造成的细胞损伤减弱，从而表现为耐药。顾静文等[3]发现， TOPOⅡα表达的降低与白血病耐药的产生有关。本研究亦显示，TOPOⅡα阳性患者组的CR率为92.31%，明显高于表达阴性患者组的58.82%，两组间差异有统计学意义，表明TOPOⅡα的表达降低也是导致白血病疗效差及预后不良的因素之一。本研究通过对单一多药耐药蛋白表达及多重耐药蛋白表达与白血病疗效及预后关系的分析，发现虽然单一PGP、MRP1的表达增高或TOPOⅡα的表达降低能够预测白血病的临床疗效和预后，但仍然有PGP和MRP1表达阴性的患者表现为多药耐药。说明只靠单一多药耐药蛋白的表达来预测疗效及预后会造成一定的偏差。通过联合多个耐药蛋白与白血病疗效及预后关系的分析，发现多种多药耐药蛋白表达综合分析能够更准确地预测急性白血病的耐药和预后，指导白血病的合理用药及，使患者达到最佳治疗效果。
【】
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